檢測腐敗病原菌的特異性引物及多重PCR檢測試劑盒的製作方法
2023-04-29 07:14:16
本發明屬於生物檢測領域，具體涉及一種檢測腐敗病原菌的特異性引物及多重pcr檢測試劑盒。
背景技術：
低溫肉製品是指通過蒸、煮、燻、烤等加工熟制的一類肉製品，加工工藝是常壓下進行，往往溫度低於100℃、肉製品中心溫度只有72-85℃，因此低溫肉製品在加工的過程中蛋白質變性適度，具有肉質結構緊密，彈性大，咀嚼感好，鮮嫩、多汁等特點，同時又克服了高溫肉製品存在的口感差、風味差、營養成分損失多種缺點，最大限度地保持了肉製品的原有營養和風味，很受消費者青睞，是未來肉製品發展的方向。但是，由於其特殊的加工工藝，從而導致肉製品滅菌不徹底，在後續儲存和銷售過程中，一旦條件適宜或受到汙染，產品中殘留的細菌就會迅速生長繁殖，導致腐敗，使肉製品營養劣化，嚴重影響產品安全性，威脅消費者健康。研究表明，低溫肉製品中的優勢菌群往往是導致食品腐敗變質的主要菌群。腐生葡萄球菌和溶酪大球菌是低溫肉製品中最常見的兩種腐敗病原菌，嚴重威脅食品安全。腐生葡萄球菌屬於葡萄球菌屬，為革蘭氏陽性球菌，為條件致病菌，是引起年輕女性尿路感染的較常見的病原菌之一。溶酪大球菌為革蘭氏陽性球菌，通常分離自動物皮膚和動物產品，其直徑是葡萄球菌的2-4倍。溶酪大球菌的進化與人類病原菌金黃色葡萄球菌和炭疽芽胞桿菌密切相關，在適宜的條件下，也會引起機體疾病。
腐生葡萄球菌是希臘香腸中的優勢菌，也是中國侗族傳統發酵肉中常見的菌種。同時，腐生葡萄球菌和溶酪大球菌是鹽水鴨中的優勢細菌，與鹽水鴨在貯藏過程中品質發生劣變、貨架期短密切相關，很大程度上影響了產品的銷售、流通，給企業造成巨大的經濟損失。因此，監測和控制產品中這類腐敗菌對企業發展極為關鍵。
目前，對於肉製品中腐敗菌的檢測和鑑定，主要還是應用傳統的細菌分離培養與細菌生理生化反應相結合的方法。在傳統分離鑑定方法中，首先對樣品進行平板培養，挑取不同菌落純化，對各單菌落進行菌落形態和菌體形態觀察，並進行生理生化反應等鑑定菌株。在實際操作中，人們發現傳統方法存在費時費力等諸多難題。因此，更加簡單、準確、快速的鑑定方法在實踐中具有重要意義。腐生葡萄球菌和溶酪大球菌作為低溫肉製品中常見的腐敗病原菌，建立對其進行快速鑑定的方法對於保障食品安全和人類健康至關重要。
pcr方法簡便、快速、特異性和敏感性好，在實踐中得到廣泛的推廣應用。多重pcr技術是在常規pcr的基礎上改進而來，即在一個pcr反應體系中，通過添加多對引物，對多個靶點序列進行擴增、檢測，其反應原理、試劑組成和操作過程與常規pcr一致，具有更加高效、經濟的特點。
技術實現要素：
針對現有技術的不足，本發明提供了兩對從低溫肉製品中檢測腐生葡萄球菌和溶酪大球菌的特異性引物及相應的pcr檢測試劑盒。本發明的試劑盒能夠大批量檢測臨床樣本，並且耗時短，成本低，操作簡單方便。
本發明提供兩對從低溫肉製品中檢測腐生葡萄球菌和溶酪大球菌的特異性引物，所述特異性引物的核苷酸序列為：
引物對1：腐生葡萄球菌
上遊引物mid-f：5』-ttacgctatataaacaaataat-3』
下遊引物mid-r：5』-atgactagtgtatggattgtt-3』。
引物對2：溶酪大球菌
上遊引物duf-f：5』-acgagtgcgaaatttgcgag-3』
下遊引物duf-r：5』-tccacatcgacctcacatcg-3』。
其中引物對1上遊引物mid-f和下遊引物mid-r均位於腐生葡萄球菌mid基因上；引物對2上遊引物duf-f和下遊引物duf-r均位於溶酪大球菌duf基因上。
本發明的第二個目的是提供一種從低溫肉製品中檢測腐生葡萄球菌和溶酪大球菌的多重pcr試劑盒，所述試劑盒包括特異性引物，所述特異性引物的核苷酸序列為：
引物對1：腐生葡萄球菌
上遊引物mid-f：5』-ttacgctatataaacaaataat-3』
下遊引物mid-r：5』-atgactagtgtatggattgtt-3』。
引物對2：溶酪大球菌
上遊引物duf-f：5』-acgagtgcgaaatttgcgag-3』
下遊引物duf-r：5』-tccacatcgacctcacatcg-3』。
優選地，所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。
進一步地，所述陽性對照為含有腐生葡萄球菌mid基因的部分核苷酸序列的重組質粒，該部分核苷酸序列的長度為201bp，具體序列參見序列表中seqidno.1；以及所述陽性對照為含有溶酪大球菌duf基因的部分核苷酸序列的重組質粒，該部分核苷酸序列的長度為390bp，具體序列參見序列表中seqidno.2。
本發明的第三個目的是提供上述試劑盒的使用方法，是以待測dna為模板，利用上述試劑盒所述的特異性引物進行pcr擴增，將擴增產物電泳，若擴增到約201bp的dna片段，判為腐生葡萄球菌陽性，若擴增到約390bp的dna片段，判為溶酪大球菌陽性，若擴增到約201bp和390bp的dna片段，判為腐生葡萄球菌和溶酪大球菌陽性；反之，判為陰性。
優選地，所述pcr反應條件為：95℃5min，35個循環(95℃30s，53℃30s，72℃30s)，最後72℃10min。
本發明的第四個目的是提供一種腐生葡萄球菌和溶酪大球菌的多重pcr檢測方法，是以待測dna為模板，利用上述試劑盒所述的特異性引物進行pcr擴增，將擴增產物電泳，若擴增到約201bp的dna片段，則檢測到腐生葡萄球菌，若擴增到約390bp的dna片段，則檢測到溶酪大球菌，若同時擴增到201bp和390bp的dna片段，則檢測到腐生葡萄球菌和溶酪大球菌。
優選地，所述pcr反應條件為：95℃5min，35個循環(95℃30s，53℃30s，72℃30s)，最後72℃10min。
本發明的第五個目的是提供上述特異性引物、試劑盒、序列表中seqidno.1和seqidno.2所述的核苷酸序列在製備檢測腐生葡萄球菌和溶酪大球菌的試劑中的應用。
本發明的試劑盒的優越性包括以下方面：
a.試劑盒操作簡單方便，適合在各基層食品檢測有關單位、低溫肉製品生產廠家以及屠宰場廣泛推廣使用，本發明中的試劑盒在檢測樣品時只需要移液器、移液器槍頭、pcr儀以及臺式離心機，普通實驗室均可使用本試劑盒檢測樣本。
b.結果判定直觀，電泳後眼觀即可。
c.操作人員不必接受專業培訓，只參照說明書就可進行檢測。
d.成本低廉，經濟實惠，大多使用者均可接受。
附圖說明
圖1為本發明試劑盒的特異性檢測實驗結果；其中，泳道m為dl2000分子量標準；泳道1為腐生葡萄球菌和溶酪大球菌；泳道2為腐生葡萄球菌；泳道3為溶酪大球菌；泳道4-5為大腸桿菌、泳道6-7為沙門氏菌、泳道8-9為巴氏桿菌、泳道10-11為鴨疫裡默氏桿菌、泳道12-13為松鼠葡萄球菌、泳道14-15為金黃色葡萄球菌、泳道16-17為糞腸球菌、泳道18-19為屎腸球菌、泳道20為陰性對照無菌水。
圖2為本發明試劑盒的敏感性檢測實驗結果；其中，泳道m為dl2000分子量標準；泳道1-7的dna模板量分別為10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg。
具體實施方式
以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為常規生化試劑。
實施例1
本發明的檢測低溫肉製品中腐生葡萄球菌和溶酪大球菌的多重pcr檢測試劑盒包括：
1.2×pcrtaqmix5支(250μl/支)；
2.引物對1：上遊引物mid-f1支(50μl/支)；下遊引物mid-r1支(50μl/支)
3.引物對2：下遊引物duf-f1支(50μl/支)；下遊引物duf-r1支(50μl/支)
4.陽性對照腐生葡萄球菌dna1支(250μl/支)；陽性對照溶酪大球菌dna1支(250μl/支)
5.陰性對照dna1支(250μl/支)；
6.滅菌去離子水1支(1000μl/支)。
上述試劑盒可檢測50份樣本，-20℃凍存，保存期為1年。
其中，2×pcrtaqmix為商品化試劑；
引物對1：腐生葡萄球菌
上遊引物mid-f：5』-ttacgctatataaacaaataat-3』
下遊引物mid-r：5』-atgactagtgtatggattgtt-3』。
引物對2：溶酪大球菌
上遊引物duf-f：5』-acgagtgcgaaatttgcgag-3』
下遊引物duf-r：5』-tccacatcgacctcacatcg-3』。
該引物對序列可由人工合成。
陽性對照dna：以腐生葡萄球菌的基因組dna為模板，以本發明中涉及的mid-f和mid-r為引物，擴增目的片段。擴增程序為：95℃5min，35個循環(95℃30s，53℃30s，72℃30s)，最後72℃10min。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用商品化試劑盒回收、純化目的dna片段，與pmd19-t載體連接，轉化感受態大腸桿菌dh5α，塗布含80μg/ml氨苄青黴素的營養肉湯瓊脂平板，過夜培養後挑取單克隆菌株，接種到含80μg/ml氨苄青黴素的5ml營養肉湯內，37℃，200rpm，培養至對數生長期，經測序鑑定正確的菌株為陽性菌株。用細菌dna提取試劑盒提取陽性菌株中的重組質粒pmd-mid，作為陽性對照；溶酪大球菌的陽性重組質粒pmd-duf的製備過程參照pmd-mid重組質粒的構建。
陰性對照dna：金黃色葡萄球菌cvcc1882購買於中國獸醫藥品監察所。取甘油凍存的cvcc1882菌株5μl，接種到5ml營養肉湯內，37℃，200rpm，培養至對數生長期，用細菌dna提取試劑盒提取其基因組dna，作為陰性對照；
滅菌去離子水：去離子水121℃高壓滅菌30min。
實施例2
本發明的檢測低溫肉製品中腐生葡萄球菌和溶酪大球菌的多重pcr試劑盒使用方法為：
1.從純細菌培養物、低溫肉製品(比如香腸、臘肉、鹹水鴨等)、腐敗食物等病料中提取總dna。dna的提取可使用商品化試劑盒。
2.將試劑盒中的2×pcrtaqmix、引物對1(上遊引物mid-f、下遊引物mid-r)、引物對2(下遊引物duf-f、下遊引物duf-r)、滅菌去離子水和提取的dna模板配製成pcr反應液，總體系50μl。同時用試劑盒中的陽性對照dna作為模板，擴增陽性對照；用試劑盒中的陰性對照dna作為模板，擴增陰性對照。pcr反應液的具體配製方法如表1：
表1pcr反應液的配製方法
3.將上述配製好的pcr反應液置於pcr儀中，擴增目的片段，擴增程序如下：95℃5min，35個循環(95℃30s，53℃30s，72℃30s)，最後72℃10min。
4.電泳觀察：取擴增產物各10μl，dl2000分子質量標準6μl，以1％瓊脂糖凝膠，120v電壓下電泳30min。用凝膠紫外分析儀觀察，照相保存。擴增目的片段大小為201bp和390bp。
5.結果判定：陽性對照擴增到目的片段，陰性對照無目的片段時試驗成立。若樣品擴增到約201bp的dna片段，判為腐生葡萄球菌陽性，若樣品擴增到約390bp的dna片段，判為溶酪大球菌陽性，若樣品擴增到約201bp和390bp的dna片段，判為腐生葡萄球菌和溶酪大球菌陽性；反之，若無條帶，判為陰性。
6.將擴增產物進行測序，其核苷酸序列為腐生葡萄球菌mid基因的部分核苷酸序列，長度為201bp。測序得到的核苷酸序列如下：
seqidno.1
ttacgctatataaacaaataattctataatggcaataattaaaaagatcaagaatactatgccatatatattattcttcttaacacttttagcattggcatttttttgtttcgctttactatttaaattagaaaagaaagtgatgccagaataaacagcaataagtaccgttattgcaaaaacaatccatacactagtcat
將擴增產物進行測序，其核苷酸序列為溶酪大球菌duf基因的的部分核苷酸序列，長度為390bp。測序得到的核苷酸序列如下：
seqidno.2
tacgagtgcggaatttgcgagttgaaacgggtagttgaactttgcgctattttccaggaacatatcgttatttctaaggacccattcgtcattatctgtcttcacatagtccagatctaagtccagatacgtgatattaccatctctatcgcgttcacatggagaagagatattacagaatatcttaatgggttgataagccttatctagagcgatagaaacagtataaccatgatactttggaagaaaatgaagtgttttatactgtaatgggatatcaatatttttgataaagtgtcggagtattgtcgtttcatcacagatgacaagaaagtattcttctgtttcttttaacagcataccttctacctcgatgtgaggccgatgtggaa
實施例3
本發明試劑盒的特異性檢測
用細菌dna提取試劑盒提取10株松鼠葡萄球菌、5株金黃色葡萄球菌、5株糞腸球菌、5株屎腸球菌、10株大腸桿菌、10株沙門氏菌、10株巴氏桿菌、5株鴨疫裡默氏桿菌的基因組dna，以這些dna樣本作為模板，用本發明中的試劑盒進行pcr檢測。結果表明，松鼠葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、鴨疫裡默氏桿菌均為陰性，表明試劑盒特異性良好。
實施例4
本發明試劑盒的敏感性檢測
提取腐生葡萄球菌和溶酪大球菌的基因組dna，分光光度計法測定其dna初始濃度為280ng/μl，調整其濃度至10ng/μl，然後依次稀釋10倍，共得到7個濃度的dna模板，其濃度梯度分別為10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl。每個濃度的dna各取1μl作模板，分別用本發明涉及的試劑盒進行pcr擴增。檢測結果表明，本發明中的試劑盒檢測限量為腐生葡萄球菌基因組dna100pg；溶酪大球菌的基因組dna10pg，說明試劑盒敏感性良好。
實施例5
從低溫肉製品(香腸、臘肉、鹹水鴨)中採集到疑是腐敗菌汙染的樣本87個，無菌取適量組織，用通用型基因組dna提取試劑盒從組織中提取總dna，每份dna樣本取5μl作為模板，用本發明涉及的試劑盒分別進行檢測。同時，將組織塗布在含8％綿羊血的巧克力平板上，置於37℃，含5％二氧化碳的培養箱內培養24h，進行細菌分離鑑定。兩種方法的檢測結果為：細菌分離方法中陽性的樣本有71份，陰性的有16份。用本發明的試劑盒進行檢測，上述71份陽性的樣本全部為陽性；16個陰性樣本中有12份為陽性，4份為陰性。兩種方法的符合率為71+4/87＝86.2％，說明本發明涉及的試劑盒比傳統細菌分離鑑定方法敏感。
最後應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對於本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
序列表
sequencelisting
中國農業科學院蘭州獸醫研究所
檢測腐敗病原菌的特異性引物及多重pcr檢測試劑盒
2
patentinversion3.5
1
199
dna
人工序列
1
ttacgctatataaacaaataattctataatggcaataattaaaaagatcaagaatactatgccatatata
ttattcttcttaacacttttagcattggcatttttttgtttcgctttactatttaaattagaaaagaaag
tgatgccagaataaacagcaataagtaccgttattgcaaaaacaatccatacactagtcat201
2
392
dna
人工序列
2
tacgagtgcggaatttgcgagttgaaacgggtagttgaactttgcgctattttccaggaacatatcgttatttctaaggacccattcgtcattatctgtcttcacatagtccagatctaagtccagatacgtgatattaccatctctatcgcgttcacatggagaagagatattacagaatatcttaatgggttgataagccttatctagagcgatagaaacagtataaccatgatactttggaagaaaatgaagtgttttatactgtaatgggatatcaatatttttgataaagtgtcggagtattgtcgtttcatcacagatgacaagaaagtattcttctgtttcttttaacagcataccttctacctcgatgtgaggccgatgtggaa392