一種小通草懸浮細胞的快速繁殖方法

2023-05-02 02:22:26 2

一種小通草懸浮細胞的快速繁殖方法
【專利摘要】本發明研究了一種小通草懸浮細胞的快速繁殖方法，包括小通草無菌葉片的獲得、愈傷組織的誘導、愈傷組織的增殖、懸浮細胞的培養及優化等步驟，本發明採用組織培養方法可以獲得大量的小通草懸浮細胞，品質好，次生代謝物含量高，為小通草藥用資源的開發和利用提供研究基礎。
【專利說明】 一種小通草懸浮細胞的快速繁殖方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及小通草組織培養的快繁方法，屬於植物【技術領域】。

【背景技術】
[0002]小通草,別名小通花,《eW/a AeJViflgiae旌節花科,落葉灌木或小喬木,高達5m。小枝密被白色小皮孔。原產中國，長江流域及秦嶺以南均可生長，喜光照，稍耐陰，適應性強，較耐寒，在排水良好的沙質土壤或輕質粘壤土中生長最佳。淡，平。清熱利水，通乳。用於尿路感染，尿閉或尿少，熱病口渴，小便黃赤，乳汁不通。生於海拔500-2500m的山谷、溪邊、雜木林下及灌叢中。木髓中含灰分5.95%，脂肪1.07%，蛋白質1.11%，粗纖維48.73%，戊聚糖5%及糖醛酸28.04%，其多糖的氫氧化鈉提取物經水解得到α -半乳糖，葡萄糖與木糖，而用草酸銨提取的提取物水解後則得到半乳糖醛酸；還含天冬氨酸、蘇氨酸、侶氨酸、苯丙氨酸等13種胺基酸以及鈣、鋇、鎂、鐵等18種微量元素；木部含木質素。葉含通脫木皂甙L-1I a、L-1I b、L-1I c、L-1I d，其中 L-1I a 是 L-1I c 的後生產物，而 L-1I b 也可能是L-1I d的後生產物，還含通脫木皂甙元A-J，及原通脫木皂甙元Al、A2和槲皮甙，目前尚未進行人工繁殖。


【發明內容】

[0003]本發明所要解決的技術問題是提供一種小通草組織培養的快繁方法，本發明採用組織培養方法可以獲得大量的小通草懸浮細胞，品質好，次生代謝物含量高，為小通草藥用資源的開發和利用提供研究基礎。
[0004]本發明所要解決的技術問題是通過以下方案來實現的:
取小通草幼嫩的葉片，流水衝洗20min，超淨工作檯上25mgL抗菌素處理25min，無菌水衝洗5次，消毒處理過的小通草幼嫩葉片接入DKW+ZT1.0mg/L+2,4-D0.15mg/L+地黴素5mg/L,附加0.7%瓊脂和30g/L蔗糖的培養基中進行愈傷組織誘導，pH5.90，暗光照培養，溫度25°C，誘導出來的愈傷組織放入培養基DKW+TDZ0.04mg/L+ZT2.0mg/L進行愈傷組織增殖培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.90，光照15001x，溫度25°C，增殖出來結構鬆散的愈傷組織接入 1/3MS+ZT1.0mg/L+IAA0.01mg/L+ 甘氨酸 15_20ppm+ 絲氨酸 8-lOppm+ 苯丙氨酸4-5ppm+半胱氨酸8-10ppm培養基中進行懸浮細胞培養，附加鹿糖30g/L,pH5.9,光照20001x，溫度25°C，採用水平振蕩裝置，每250mL錐形瓶中放入60mL培養液，震動頻率95r/min0
[0005]採用本發明製備的小通草懸浮細胞產量大，能耗少，品質高。
[0006]下面將結合【具體實施方式】對本發明作進一步闡述，但本發明要求保護的範圍並不局限於下列實施方式。

【具體實施方式】
[0007]實施例1 取小通草幼嫩的葉片，流水衝洗20min，超淨工作檯上25mgL抗菌素處理25min，無菌水衝洗5次，消毒處理過的小通草幼嫩葉片接入DKW+ZT1.0mg/L+2，4-D0.15mg/L+地黴素5mg/L，附加0.7%瓊脂和30g/L蔗糖的培養基中進行愈傷組織誘導，pH5.90，暗光照培養，溫度250C，誘導出來的愈傷組織放入培養基DKW+TDZ0.04mg/L+ZT2.0mg/L進行愈傷組織增殖培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.90，光照15001x，溫度25°C，增殖出來結構鬆散的愈傷組織接入1/3MS+ZT1.0mg/L+IAA0.01mg/L+甘氨酸15ppm+絲氨酸8ppm+苯丙氨酸4ppm+半胱氨酸8ppm培養基中進行懸浮細胞培養，附加蔗糖30g/L，pH5.9，光照20001x，溫度25°C，採用水平振蕩裝置，每250mL錐形瓶中放入60mL培養液，震動頻率95r/min，細胞增長率78%。
[0008]實施例2
取小通草幼嫩的葉片，流水衝洗20min，超淨工作檯上25mgL抗菌素處理25min，無菌水衝洗5次，消毒處理過的小通草幼嫩葉片接入DKW+ZT1.0mg/L+2，4-D0.15mg/L+地黴素5mg/L，附加0.7%瓊脂和30g/L蔗糖的培養基中進行愈傷組織誘導，pH5.90，暗光照培養，溫度250C，誘導出來的愈傷組織放入培養基DKW+TDZ0.04mg/L+ZT2.0mg/L進行愈傷組織增殖培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.90，光照15001x，溫度25°C，增殖出來結構鬆散的愈傷組織接入1/3MS+ZT1.0mg/L+IAA0.01mg/L+甘氨酸20ppm+絲氨酸1ppm+苯丙氨酸5ppm+半胱氨酸1ppm培養基中進行懸浮細胞培養，附加蔗糖30g/L，pH5.9，光照20001x，溫度25°C，採用水平振蕩裝置，每250mL錐形瓶中放入60mL培養液，震動頻率95r/min，細胞增長率82%。
[0009]實施例3
取小通草幼嫩的葉片，流水衝洗20min，超淨工作檯上25mgL抗菌素處理25min，無菌水衝洗5次，消毒處理過的小通草幼嫩葉片接入DKW+ZT1.0mg/L+2，4-D0.15mg/L+地黴素5mg/L，附加0.7%瓊脂和30g/L蔗糖的培養基中進行愈傷組織誘導，pH5.90，暗光照培養，溫度250C，誘導出來的愈傷組織放入培養基DKW+TDZ0.04mg/L+ZT2.0mg/L進行愈傷組織增殖培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.90，光照15001x，溫度25°C，增殖出來結構鬆散的愈傷組織接入1/3MS+ZT1.0mg/L+IAA0.01mg/L+甘氨酸20ppm+絲氨酸8ppm+苯丙氨酸5ppm+半胱氨酸8ppm培養基中進行懸浮細胞培養，附加蔗糖30g/L，pH5.9，光照20001x，溫度25°C，採用水平振蕩裝置，每250mL錐形瓶中放入60mL培養液，震動頻率95r/min，細胞增長率87%。
【權利要求】
1.一種小通草懸浮細胞的快速繁殖方法，包括小通草無菌葉片的獲得、愈傷組織的誘導、愈傷組織的增殖、懸浮細胞的培養及優化，其主要步驟如下: (1)取小通草幼嫩的葉片，對其進行消毒處理； (2)取步驟(I)消毒處理過的小通草幼嫩葉片接入DKW+ZT1.0mg/L+2,4-D0.15mg/L+地黴素5mg/L，附加0.7%瓊脂和30g/L蔗糖的培養基中進行愈傷組織誘導，pH5.90，暗光照培養，溫度25 0C ； (3)取步驟(2)誘導出來的愈傷組織放入培養基DKW+TDZ0.04mg/L+ZT2.0mg/L進行愈傷組織增殖培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.90，光照15001x，溫度25°C ； (4)取步驟(3)增殖出來結構鬆散的愈傷組織接入1/3MS+ZT1.0mg/L+IAA0.0 lmg/L+甘氨酸15-20ppm+絲氨酸8-10ppm+苯丙氨酸4_5ppm+半胱氨酸8-10ppm培養基中進行懸浮細胞培養，附加蔗糖30g/L，pH5.9，光照20001x，溫度25°C。
2.按照權利要求1所述的一種小通草懸浮細胞的快速繁殖方法，其特徵在於:步驟(I)中所述小通草無菌葉片的獲得為，取小通草幼嫩的葉片，流水衝洗20min，超淨工作檯上25mgL抗菌素處理25min,無菌水衝洗5次。
3.按照權利要求1所述的一種小通草懸浮細胞的快速繁殖方法，其特徵在於:步驟(4)中小通草懸浮細胞培養採用水平振蕩裝置，每250mL錐形瓶中放入60mL培養液，震動頻率 95r/min。
【文檔編號】A01H4/00GK104255520SQ201410540620
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月14日 優先權日:2014年10月14日
【發明者】劉東鋒, 楊成東 申請人:南京帝道農業科技有限公司