矽柱快速再生方法與流程
2023-05-02 08:49:56 2
本發明屬於生物技術領域，具體為矽柱快速再生方法。
背景技術：
傳統的分子克隆方法費時費力；因此，許多實驗方法或技術被商業試劑盒取代，如1)用於pcr產物(或dna)純化的pcr清潔試劑盒(pcr即聚合酶鏈式反應是基因或dna擴增的主要手段)，2)用於dna酶切產物純化的瓊脂糖膠抽提試劑盒和3)質粒提取試劑盒。利用這些試劑盒加快了分子克隆的進程和研究的效率。由於試劑盒相對昂貴而且產品的設計主要是一次性使用，試劑盒的使用也耗費了許多實驗室的財力。
上述試劑盒主要由矽柱和實驗試劑組成，其核心材料是矽柱。一次性使用的試劑盒，一方面，造成大量的垃圾和環境問題，另一方面，也造成資金和資源的浪費。
技術實現要素：
針對上述技術問題，本發明提供一種使矽柱快速再生的方法，並對再生的矽柱進行了功能鑑定。
具體技術方案為：
矽柱快速再生方法，包括以下過程：
(1)取矽柱置於收集管中，加0.75ml蒸餾水，進行離心分離，棄去收集管中廢液；
(2)向矽柱中加入矽柱再生液，靜置3分鐘進行離心分離，棄去收集管中廢液；所述的矽柱再生液為磷酸溶液；
(3)重複步驟(2)五次；
(4)用0.75ml蒸餾水，離心分離、清洗矽柱，棄去收集管中廢液；
(5)將矽柱移至無菌離心管中，離心1分鐘，除盡矽柱中殘留水分即可得到快速再生的矽柱；
以上所述的離心分離過程為採用臺式離心機中，在室溫下，以12000rpm速度離心1分鐘。
所述的磷酸溶液濃度為1mol/l。
本發明提供的矽柱快速再生方法針對pcr清潔試劑盒中或瓊脂糖膠抽提試劑盒中的矽柱進行再生和利用，可以為實驗室節約資金，為社會節約資源，是更加環保的使用矽柱的方法。
附圖說明
圖1為實施例中的標準曲線；
圖2為實施例中不同濃度的磷酸對矽柱dna汙染清除效果分析；
圖3為實施例中再生矽柱與未使用過的矽柱對dna純化效果比較分析；
圖4為實施例中再生矽柱從瓊脂糖中回收、純化dna效果分析；
圖5為實施例中再生矽柱多次連續使用對dna純化效果分析；
圖6為實施例中再生矽柱與原始柱對tbox5基因克隆比較分析。
矽柱再生具體實施方式
以下結合多個實驗和實施例說明本發明的具體技術方案。
實施步驟一、標準曲線的建立
為了獲得再生矽柱，最為關鍵的技術問題是清除一次性使用過的矽柱中dna汙染。為了更好地評估所使用試劑去汙染的效果，首先必須建立標準曲線。將人lif基因的dna以1:10方式連續稀釋，分別獲得濃度為1×10-2,1×10-3,1×10-4,1×10-5,1×10-6納克/微升的dna。將這些不同濃度的dna進行螢光定量pcr(qpcr)分析，將獲得qpcr結果與dna濃度的負對數(-log10)作圖，結果表明，qpcr的ct值與dna濃度的負對數成正相關，如圖1，說明標準曲線已經建立，.標準曲線由ct平均值與dna濃度的負對數繪製而成。
實施步驟二、磷酸對使用過的矽柱進行再生的方法
矽柱是由矽膜和塑料兩種材料製成的，對dna起結合作用的是矽膜中的二氧化矽(sio2)，室溫下，二氧化矽是比較耐酸鹼的化學材料。另外，磷酸核糖骨架支撐dna分子的雙螺旋結構。dna中含有大量磷酸基團，磷酸是否可用於清除dna汙染並不清楚。本實施步驟將濃磷酸分別稀釋不同的濃度，如圖2，對使用過的矽柱進行清洗。
具體方法是：1)取5支一次性使用過的矽柱(即5支矽柱已被用於純化過人類的lif基因的dna片段)並置於2ml收集管中，分別向矽柱中加0.75ml蒸餾水，將矽柱置於臺式離心機中，在室溫下，以12000rpm速度離心1分鐘。2)除去收集管的廢液，向矽柱中分別加入0.5ml不同濃度磷酸的矽柱再生液(如圖2)，靜置3分鐘，將矽柱置於臺式離心機中，在室溫下以12000rpm速度離心1分鐘後除去收集管中的廢液。3)重複步驟2)五次。4)待磷酸試劑清洗完成，用0.75ml蒸餾水再次清洗一次，棄去收集管中廢液。5)最後，將清洗過的矽柱與收集管置於離心機中以12000rpm速度離心1分鐘，除盡矽柱中殘留水分；至此，矽柱再生步驟完成。
上述步驟完成後，將再生矽柱移至1.5ml無菌離心管中，向矽柱中加入30微升去離子水，以12000rpm的速度離心1分鐘並收集、保存洗脫液。為確定何種濃度的磷酸可以更好地再生矽柱，本實施例利用上述洗脫液中dna殘留量來分析不同濃度試劑對矽柱中dna汙染的清除效果。因此，利用定量pcr(qpcr)方法和實施步驟一中建立的標準曲線，本實施例分析了各洗脫液中dna殘留濃度。結果表明，在所測試的試劑中，1mol/l磷酸溶液表現出很好的dna清除效果，洗脫液中dna殘留濃度為0.0031pg/μl，如圖2；但隨著磷酸溶液濃度增加，洗脫液中dna殘留濃度下降不是特別明顯。可見，1mol/l磷酸足夠讓使用過的矽柱進行再生。
對再生矽柱的功能鑑定：
實施步驟三、再生矽柱能有效結合與純化pcr產物(dna)
以上實驗證明1mol/l磷酸具有很好地除去矽柱中dna汙染的效果；但是，經磷酸清洗過的矽柱是否能與dna結合併有效純化pcr產物並不清楚，因此，本實施例有必要對再生矽柱的這一功能進行鑑定。本實施例利用再生矽柱以及未使用過的矽柱如axygen和qiagen的原矽柱對pcr產物純化效果進行分析。這裡分析pcr產物t-box5基因的純化效果。實驗過程如下：1)利用pcr在50微升反應體系中擴增t-box5基因，並設置3個重複。2)分別將50微升pcr產物按1:5體積加入dna結合液(250微升)。2)分別將300微升的dna混合液加入三種不同的矽柱中，以12000rpm速度離心1分鐘。3)除去管中廢液，分別向矽柱中加入600微升矽柱清洗緩衝液，以12000rpm速度離心1分鐘。4)除去管中廢液後，以12000rpm速度離心1分鐘，用1.5ml無菌離心管置換2ml廢液收集管，向矽柱中加30微升去離子水，離心收集洗脫液。5)取3微升用於瓊脂糖凝膠電泳並進行成像分析。
tbox5基因(1557bp)pcr擴增後，用不同矽柱進行純化並對純化產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖3所示，qiagen再生矽柱與未使用過的矽柱表現出相似的產量。而再生矽柱比axygen矽柱表現出更高的產量。說明再生矽柱能與pcr產物(dna)結合併能夠有效純化dna。
本實施步驟使用的dna結合液，矽柱清洗緩衝液為qiagen試劑盒中提供的試劑。
實施步驟四、再生矽柱能夠有效地於從瓊脂糖膠中回收與純化dna
再生矽柱是否能夠從瓊脂糖膠回收和純化dna還不清楚，因此有必要對此功能進行鑑定。dna酶切後進行瓊脂糖凝膠電泳，利用再生矽柱從瓊脂糖凝膠中進行回收和純化，具體方法如下：
1)分別取1微克純化的pcr產物，利用限制性酶bamhi和ecori進行酶切2小時。2)酶切完成後，將酶切後的樣品進行瓊脂糖凝膠電泳30分鐘。3)將瓊脂糖凝膠置於紫外燈下，用手術刀片將dna目的帶位置的凝膠切出，置於稱量過的1.5ml離心管中。4)將膠和離心管於電子天平中稱量每塊膠的重量，向離心管中加入3倍膠重量的膠溶解液並置於55℃的水浴鍋中溶解。5)待膠溶解後，向離心管中加入1倍膠重量的異丙醇並徹底混合。6)分別將膠混合液移至三個不同的矽柱中(兩個新矽柱(axygen,qiagen)和一個再生柱)，以12000rpm速度離心1分鐘。7)除去廢液，向矽柱中加600微升矽柱清洗液，以12000rpm速度離心1分鐘。8)除去廢液，將矽柱再次離心1分鐘。9)用1.5ml無菌離心管置換2ml廢液收集管，向矽柱加30微升去離子水，以12000rpm速度離心1分鐘，收集洗脫液。10)各取5微升洗脫樣品進行瓊脂糖凝膠電泳分析進行成像分析。
tbox5基因擴增後，用bamhi和ecori進行酶切，隨後進行瓊脂糖凝膠電泳，將含有目的dna膠切出，利用不同的矽柱從膠中回收、純化dna。最後，將回收的dna進行瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖4所示，利用qiagen再生矽柱純化獲得的dna量與未使用過的矽柱純化所獲得的dna量差別不大。說明再生矽柱能夠從瓊脂糖膠中回收與純化dna。
本實施步驟使用的膠溶解液，矽柱清洗緩衝液為qiagen試劑盒中提供的試劑。
實施步驟五、再生矽柱能反覆使用
以上步驟證明了再生矽柱能有效地純化dna，但這種再生矽柱是否可以反覆使用並不清楚。本實驗利用再生矽柱多次純化tbox5基因pcr產物。將使用過的矽柱用1mol/l磷酸按照實施步驟二中描述的方法進行清洗。dna純化按照實施步驟三中描述的方法進行，同時以qiagen試劑盒中未使用的矽柱設為對照，將pcr產物同時純化。再生矽柱採用本發明提供的矽柱再生液完成。將矽柱五次連續清洗和純化的dna(各取5微升)一起進行瓊脂糖凝膠電泳和成像分析。
tbox5基因pcr擴增後，連續使用同一再生矽柱進行純化並對純化產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖5所示，與新矽柱相比，5次純化的dna量沒有顯著差異。說明再生矽柱能反覆使用至少5次以上。
實施步驟六、再生矽柱純化的dna產物可用於基因克隆
將t-box5基因進行pcr擴增，將pcr產物和克隆載體prsetb利用限制性酶bamhi和ecori進行酶切。按照實施步驟四描述的方法，將dna從瓊脂糖膠中回收、純化。利用連接酶將純化的dna包括載體和目的片段進行連接反應。連接反應在16℃下進行。連接體系如下：
1微升載體prsetb(50ng)；4微升目的片段t-box(80ng)；2微升10x連接緩衝液；1微升連接酶；12微升去離子水；共20微升反應體系。
連接反應進行12小時後，取2微升連接產物與45微升感受態細胞冰上孵育45分鐘，孵育結束將樣品置於90℃水浴鍋中熱激1分鐘，將樣品再次冰浴2分鐘，然後將樣品均勻塗在lb培養皿上，隨後在37℃恆溫箱中培養過夜。第二天挑取菌落接種於3毫升lb培養液中培養過夜。第三天收集細菌用axygen質粒提取試劑盒提取質粒並進行酶切鑑定和瓊脂糖凝膠電泳、成像分析。結果顯示，利用再生矽柱純化的dna與利用其他矽柱純化的dna，其克隆的結果沒有差異(圖6)。說明再生矽柱製備的dna是可以用於基因克隆的。