一種多效價活疫苗、其製備方法及應用的製作方法

2023-05-22 23:16:01

專利名稱：：一種多效價活疫苗、其製備方法及應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於水產養殖動物病害防治技術，具體地說，涉及一種多效價活疫苗、其製備方法及應用。
背景技術：
：目前，規模化、集約化、高密度養殖模式逐漸成為我國海水魚類養殖業的發展主流。然而隨著海水養殖業的不斷穩歩發展，各種病害問題R益突出，對養殖的產量及成長造成嚴重影響，例如，在我國，近幾年發展起來的海水網箱養殖和工廠化養殖魚類的突發性、暴發性疾病頻繁發生，海水養殖平均死亡損失率在30%以上，病害問題己成為制約海水養殖業健康發展的重要因素。疫苗具有針對性強、抗病周期長、可終身免疫、效果顯著和防治主動的特點，因此，接種疫苗在現代水產養殖規範中正成為世界各國研究和開發的主要前沿和應用領域。由於水產養殖業的產業特點，要求病害防治技術必須經濟、應用實施方便。因此，適用於水產養殖業的疫苗產品的丌發除高效價的技術要求外，免疫成本必須低廉，不能超出養殖業的承受能力。其中，減毒活菌疫苗因具有給藥方便、免疫效價高、成本低廉、可丌發廣譜疫苗的新技術優勢，已成為當前國際上水產養殖用疫苗研究和開發的熱點和前沿領域。近年來，隨著對病原基因背景的深入了解以及重組DNA技術的不斷發展，將編碼某一特定病原體蛋白的外源基因插入無毒力病毒或細菌疫苗株的基因組的某一部位，使其高效表達，但不影響該疫苗株的正常生長與繁殖。用這種重組體作為活疫苗進行接種時，病毒或細菌能產生特定的外源蛋白，並誘發機體產生特異性免疫應答。目前，這種能針對多種病毒病害的多效價疫苗也已成為疫苗開發的國際甜沿和熱點領域。其中，利用高效信號肽分泌表達外源病原蛋白已成為多效價疫苗開發中的一種重要技術手段，並且該技術己在大腸桿菌及沙門氏菌的疫苗丌發中得到了成功應用(GentschevI,etal.The￡.co//ot-hemolysinsecretionsystemanditsuseinvaccinedevelopment.TrendsMicrobiol,2002(10):39-45及RussmannH,etal.DeliveryofepitopesbytheSalmonellatypeIIIsecretionsystemforvaccinedevelopment.Science,1998(281):565-568)，但在鰻弧菌疫苗的研製中還未見相關技術應用的報導。弧菌是導致海水養殖魚類細菌性疾病的一種最為常見的病原體，可導致魚類弧菌病(Vibriosis),其發生溫度範圍大，季節長，地域廣，危害的種類多，有鱸科、鯔科以及鮃、鰈類等大多數海水魚類，其中，鰻弧菌(n&rZofl"gw7/flnw7)、溶藻弧菌(W6Woa/g/w/少rtcz^)、嗜水氣單胞菌"era/wo"^/9^ro;^7a)等嚴重危害我國水產養殖魚類中牙鮃、大菱鮃、真鯛和鱸魚等名貴經濟魚種。同時，這些病原菌普遍存在於淡水、汙水、淤泥和土壤中，對水產動物、畜禽和人類均有致病性，可引起多種水產動物的出血性敗血症和人類腹瀉，給養殖業造成巨大經濟損失，也給人類健康帶來威脅。由於養殖魚類多同時遭受多種弧菌病原體的侵害，所以，弧菌病疫苗多以幾種弧菌病病原體的滅活聯苗產品居多。但尚未見以鰻弧菌和嗜水氣單胞菌為主要防治對象的商品化的多效價弧菌病活菌疫苗。
發明內容本發明的目的在於，提供一種重組質粒。本發明還有一個目的在於，提供該重組質粒的製備方法。本發明還有一個目的在於，提供一種多效價活疫苗。本發明還有一個目的在於，提供該多效價活疫苗的製備方法。本發明還有一個目的在於，提供該多效價活疫苗的應用。本發明提供的重組質粒包含鰻弧菌金屬蛋白酶的信號肽和嗜水氣單胞菌3-磷酸甘油脫氫酶的融合基因序列，其中，鰻弧菌金屬蛋白酶信號肽介導3-磷酸甘油脫氫酶的分泌。本發明提供的重組質粒的製備方法包括A)構建信號肽-3-磷酸甘油脫氫酶融合基因；B)酶切融合基因和載體；C)將酶切的融合基因和酶切的載體進行連接。本發明提供的多效價活疫苗由本發明提供的重組質粒轉化鰻弧菌減毒株獲得。本發明提供的多效價活疫苗的製備方法包括A)構建包含鰻弧菌金屬蛋白酶的信號肽和嗜水氣單胞菌3-磷酸甘油脫氫酶的融合基因的重組質粒；B)將步驟A)獲得的重組質粒轉化鰻弧菌減毒株。本發明提供的多效價活疫苗的應用為用於預防鰻弧菌和嗜水氣單胞菌導致的魚類疾病。使用本發明提供的減毒疫苗，具有明顯的多效價免疫保護力，可作為鰻弧菌和嗜水氣單胞菌的活疫苗，並具有良好的應用前景。圖1為本發明製備獲得的重組質粒的結構圖譜，其中，圖la為pGap質粒的結構圖譜，圖lb為pGap-hlyA質粒的結構圖譜，圖lc為Gap-rtxA質粒的結構圖譜，圖ld為pGap-vah3質粒的結構圖譜，圖le為pGap-empA質粒的結構圖譜。圖2為上清組分和胞內組分的ELISA檢測和Western-blot檢測結果，其中，圖2中的圖a為胞內組分的ELISA檢測結果，圖b為上清組分的ELISA檢測結果，圖c為上清組分和胞內組分的Western-blot檢測結果。在本發明的實施例中，所使用的鰻弧菌減毒株MVAV6203已於2004年9月15日提交位於武漢的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCCNo:M204066。在本發明的實施例中，所使用的嗜水氣單胞菌LSA34己於2009年6月10日提交位於武漢的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCCNo:M209124。具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用於說明本發明而非用於限定本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆實驗室手冊》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或廠商推薦的條件進行。發明人為獲得能在鰻弧菌減毒株MVAV6203(保藏號CCTCCNo:M204066)中表達及分泌嗜水氣單胞菌的3-磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)的多效價減毒活疫苗，首先構建了4種不同信號肽與嗜水氣單胞菌(保藏號為CCTCCNo:M209124)的3-磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)的序列(gopj)融合表達的質粒，並將獲得的不同質粒分別轉化到鰻弧菌減毒株MVAV6203中分別獲得重組菌株，然後將獲得的重組菌株發酵培養並進行檢測，確定了鰻弧菌金屬蛋白酶(EmpA)信號肽能介導嗜水氣單胞菌的3-磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)在減毒株MVAV6203中成功的表達及分泌至胞外，然後經體外免疫保護試驗，確定該重組菌株對鰻弧菌和/或嗜水氣單胞菌具有良好的防治效果，即該疫苗具有明顯的多效價免疫保護力，從而提供了一種多效價減毒活疫苗，具體過程如實施例所示。在本發明的下述實施例中，使用的海水生理鹽水的配方為NaC128g/L，KC10.77g/L，MgCl2,6H204.8g/L，NaHC030.11g/L，MgS04'7H203.5g/L，CaCl2'2H201.6g/L，pH7.2。溶液配製好後，過濾除菌，獲得無菌海水生理鹽水。在本發明的下述實施例中，序列片段的回收純化採用以下方法將PCR擴增獲得的片段或酶切後片段分別進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下含有目的片段的凝膠後，採用天根生化公司(TIANGEN)的凝膠回收試劑盒回收DNA，具體操作步驟參考產品說明書。在本發明的下述實施例中，使用的生物材料來源如下質豐立pi\NN-202-812:GentschevI,etal.The￡.co//oc-hemolysinsecretionsystemanditsuseinvaccinedevelopment.TrendsMicrobiol,2002(10):39-45。霍亂弧菌N16961(01,ElTor):購自美國典型菌種保藏中心，保藏號ATCC39351。鰻弧菌MVM425:LingyunZhouetal.,Secretorydeliveryofheterologousproteinsinattenuated朋gwz7/ar謂forpotentialuseinvaccindesign.ApplMicrobiolBiotechnol(2008)79:1027-1034。大腸桿菌T叩10:購自英駿生物技術(Invitrogen)公司。pUC18質粒購自寶生物(TaKaRa)公司。在本發明的下述實施例中，使用的高鹽LB培養液為在LB培養基補加NaCl至終濃度為2.5%。在本發明的下述實施例中，質粒DNA採用天根生化(TIANGEN)公司的細菌質粒小提試劑盒進行製備，具體操作步驟參考產品說明書。在本發明的下述實施例中，菌株的基因組採用天根生化公司的細菌基因組DNA抽提試劑盒進行製備，具體操作步驟參考產品說明書。實施例1、重組質粒構建1.1、引物設計設計引物hlyASP-F、hlyASP-R、rtxASP-F、rtxASP陽R、vah3SP-F、vah3SP-R、empASP-F、empASP-R、gapA-Fl/2、gapA-Rl、gapA-R2、gapA-F3、gapA-F4和gapA-R3/4，上述引物的序列及酶切位點如下所示hlyASP-F:5'-CACTCAGCAGGACAAAGCACGAAAGATGCAT-3';hlyASP陽R:5'-CGCGGATCCTTATGCTGATGTGGTC-3':rtxASP-F:5'-GATTACTTTAATGGTAACCGCGCTCAAGTG-3';rtxASP-R:5'-TGCATGCATTTACACCATCAATCCTTTTTTGTG陽3';贏/位點vah3SP-F:5'-CCGGAATTCGATGACTTCTTCTAAATTTTCG-3':vah3SP-R:5'-AGACCACTTTAATTGGGTGTTTATCTCACTAGGG-3';empASP陽F:5'-CCGGAATTCGATGAAAAAAGTACAACGTC-3':五coi/位點empASP-R:5'-AGCTTGTTCTAGTAGACTTGGATCA-3'。gapA-F1/2:5'-TAGGAGAATTCGATGACTATCAAAGTAGG-3';/位點gapA-Rl:5'-CGTGCTTTGTCCTGCTGAGTGCTTAGAGATGTGAGCGAT-3'gapA-R2:5'-ACCATTAAAGTAATCCTTAGAGATGTGAGCGAT-3';gapA-F3:5'-CAATTAAAGTGGTCTATGACTATCAAAGTAGGT-3';gapA-F4:5'-CTACTAGAACAAGCTATGACTATCAAAGTAGGTATTAAC-3';gapA-R3/4:5'-CCAATGCATTTACTTAGAGATGTGAGCGA-3'。1.2、常規PCR擴增使用上述引物進行PCR擴增，以製備目標片段，其中具體使用的模板和引物對及製備的目標片段如下所示以質粒pANN-202-812為模板，以引物hlyASP-F和hlyASP-R為引物對，擴增HlyAC端信號肽的編碼序列W少ASP;以霍亂弧菌N16961(Ol，ElTor)基因組為模板，rtxASP-F和rtxASP-R為引物對，擴增RtxAC端信號肽的編碼序列rtx^S屍；以鰻弧菌MVM425基因組為模板，分別以vah3SP-F和vah3SP-R為引物對擴增Vah3N端信號肽的編碼序列v"WS屍，以empASP-F和empASP-R為引物對，用於擴增EmpAN端信號肽的編碼序列em;^4SP;以嗜水氣單胞菌LSA34基因組為模板，分別以gapA-Fl/2和g叩A-Rl為引物對擴增ga^4J序列，以gapA-Fl/2和gapA-R2為引物對擴增gapj2序列，以gapA-F3和gapA-R3/4為弓I物對擴增ga^43序列，以gapA-F4和gapA-R3/4為引物對擴增gcy^4序列，以gapA-Fl/2和gapA-R3/4為引物對擴增gcyx4序列，即3-磷酸甘油脫氫酶的核苷酸序列。將擴增獲得的上述序列片段分別進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，並回收純化，其中，擴增獲得的各序列片段的大小分別如下WWS屍為240bp;rftc^ST5為240bp;為120bp;ew/^4S屍為120bp;ga/W及gop^/j均為996bp。1.3、重疊PCR擴增以WWS屍和基因片段為模板，gapA-Fl/2和hlyASP-R為引物對，採用重疊PCR擴增得到融合基因g"p-/7/>^;以WxASP和ga/W2基因片段為模板，gapA-Fl/2和rtxASP-R為引物對，採用重疊PCR擴增得到融合基因gap-W;c4;以raW5P和g印^基因片段為模板，vah3SP-F和gapA-R3/4為引物對，採用重疊PCR擴增得到融合基因gfl/-raW;以empA^和gapv44基因片段為模板，empASP-F和gapA-R3/4為引物對，採用重疊PCR擴增得到融合基因g^-em^4。將擴增獲得的上述序列片段分別進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，並回收純化，擴增獲得的各序列片段大小如下ga/-A/^及g^-rto4約為1.2kb;ga;)-vaW及g甲-em/M約為l.lkb。1.4、重組質粒構建使用雙酶/和Sam/f/酶切g印-W;^片段，使用雙酶￡coi/和懸Z/酶切gap-r/W，g"p-i;"W，g印-emp^及ga/^片段，將酶切後的片段分別回收純化，獲得酶切片段。同時，使用雙酶五co//和Sam///或雙酶￡coi/和PW/酶切pUC18質粒，將酶切後的質粒分別回收純化，獲得酶切質粒。將上述酶切片段分別與酶切質粒用T4DNA連接酶16'C連接過夜，分別得到重組質粒pGap-hlyA，pGap-rtxA，pGap-vah3，pGap-empA及pGap，獲得的上述重組質粒結構如圖i所示，其中，ori-為複製起始區，Plac-為lac啟動子，LacZalpha-為a-半乳糖苷酶基因，Ampicillin-為氨苄青黴素抗性基因，￡a^/、Sflm///、7^/-為對應的酶切位點。將上述重組質粒分別用CaCl2轉化法轉化大腸桿菌ToplO，得到大腸桿菌重組菌株Top10(pGap-hlyA)，ToplO(pGap-rtxA)，ToplO(pGap-vah3)，ToplO(pGap-empA)及ToplO(pGap)。實施例2、鰻弧菌重組菌株構建將鰻弧菌MVAV6203接種於50ml高鹽LB培養液中，於30'C振搖培養過夜後，再以1:100(v/v)轉接於100ml新鮮高鹽LB培養液中，在30。C下以200rpm振蕩培養至OD600值為0.6時，離心收集菌體，將菌體在冰浴中放置20-30min後，用272mM的蔗糖緩衝液洗滌菌體三次，再用蔗糖緩衝液懸浮菌體，使菌液終濃度為lxl09cfu/ml，得到鰻弧菌MVAV6203的電轉化感受態細胞。分別將重組菌株ToplO(pGap-hlyA)，ToplO(pGap-rtxA)，ToplO(pGap-vah3)，ToplO(pGap-empA)及ToplO(pG叩)進行擴增培養，收集菌體並製備獲得相應的重組質粒pGap-hlyA，pGap-rtxA，pGap-vah3，pGap-empA及pGap。利用鰻弧菌MVAV6203的電轉化感受態細胞和重組質粒pGap-hlyA,pGap-rtxA，pGap-vah3，pGap-empA及pGap分別製備相應的重組菌株，具體過程如下分別取lOOpl感受態菌懸液於一個0.2cm的電轉化杯(Bio-Rad,USA)中，分別加入重組質粒DNA10pl，混勻後在冰浴上放置10min，用電脈衝儀(Bio-RadMicroPluser，USA)進行電脈衝，其中，脈衝場強V=2kV/cm，脈衝時間t二3ms。電脈衝完畢後，菌懸液轉入1.5ml的離心管，並加入800pl高鹽LB培養液，在3(TC，200rpm恢復培養3h後，塗布於高鹽LB抗性平板(氨苄青黴素濃度200pg/ml)，3(TC靜置培養16-20h，篩選陽性克隆，得到重組菌株AV(pGap-WyA)，AV(pGap-rtxA),AV(pGap-vah3)，AV(pGap-empA)及AV(pGap)。實施例3、多效價減毒活疫苗篩選分別將在實施例2的步驟中獲得的重組菌株接種於含200^ig/rnl氨苄青黴素的LB高鹽液體培養基，200rpm，3(TC培養過夜，次日按1:100(v/v)接種於100mlLB高鹽(Amp)培養基，30°C，200rpm培養9h，收穫培養液。將lml收穫的培養液於10000g離心10min，收集上清液，作為"上清組分"。同時，將菌體沉澱經PBS(pH7.0)洗滌三次後，再用lmlPBS重懸。並將重懸液在冰浴中超聲破菌5min至菌體完全破碎，然後將得到的菌體裂解液在4'C，10000g離心5min，收集上清部分作為"胞內組分"。分別將獲得的"上清組分"和"胞內組分"進行ELISA檢測和Western-blot檢測，其中，以AV(pGap)為陰性對照，結果如圖2所示。圖2的結果顯示，候選株AV(pGap-hlyA)，AV(pGap-rtxA)及AV(pGap-vah3)未能有效的合成並分泌GAPDH融合蛋白；而候選株AV(pGap-empA)不但能正確表達GAPDH融合蛋白，其培養液的上清組分中也能檢測到GAPDH蛋白。根據圖2的結果，候選株AV(pGap-empA)能成功地將GAPDH蛋白分泌至胞外，因此，具有多效價減毒活疫苗的應用前景。實施例4、多效價減毒活疫苗對大菱鮃(71W)W)的免疫保護試驗為確定候選株AV(pGap-empA)能否作為多效價減毒活疫苗應用，發明人隨後又使用AV(pGap-empA)對大菱鮃(7W^W)進行了免疫保護試驗，具體過程如下4.1、疫苗製備取AV(pGap-empA)接種於50ml高鹽LB液體培養基(Amp)中，於30°C，200rpm培養12h。然後，取5ml生長旺盛的菌液接種於100ml新鮮高鹽LB液體培養基(Amp)中，30。C振蕩培養12h。離心收穫菌體(5000g，15min，室溫)，以無菌海水生理鹽水洗滌三次，菌體用海水生理鹽水稀釋成lxl06cfu/ml的菌懸液。4.2、免疫保護試驗試驗用魚為體重7-14g，體長8-10cm的大菱鮃，實驗前先置於水槽內適應養殖2周，以剔除不正常個體。試驗水槽每天使用海水水體替換2/3體積養殖水，水溫18士2。C。採用改良寇式法設計實驗，測得MVM425及LSA34的半數致死量LDso分別為1.66X1(^cfu/尾和1.58X10、fu/尾。將試驗用魚隨機分為4大組，每組設3個平行小組，按表2分組設置對大菱鮃進行腹腔注射免疫，其中以C組海水生理鹽水注射組作為對照組，D組GAPDH蛋白溶液與弗氏完全佐劑按l:l(v/v)混勻後進行注射。免疫4周後，各組免疫大菱鮃用鰻弧菌野生毒株MVM425、嗜水氣單胞菌LSA34及聯合感染三種方式進行腹腔注射攻毒，感染實驗分組及攻毒劑量如表2所示，其中，聯合感染時每種菌的實際攻毒劑量為各自單獨攻毒時的一半。表2、鰻弧菌減毒疫苗對大菱鮃的免疫保護試驗tableseeoriginaldocumentpage11表3、鰻弧菌減毒疫苗注射免疫大菱鮃4周後攻毒的免疫保護力tableseeoriginaldocumentpage11C-l605591.7/C-2605185/C-3604880/D-2601118.378.5根據表3的結果，減毒疫苗AV(pGap-empA)具有良好的鰻弧菌野生毒株感染防治效果，其RPS為83.6。/。，接近減毒株MVAV6203的保護力(RPS=89.1%)。同時，該減毒株對嗜水氣單胞菌也顯示具有很好的交叉保護性，其RPS達到70。/。以上，接近純蛋白GAPDH免疫達到的保護效果(RPS=78.5%)。實驗表明該疫苗保持了減毒株MVAV6203及GAPDH的免疫抗原性，具有明顯的多效價免疫保護力，擁有良好的商業價值和應用前景。綜上所述，本發明提供的減毒疫苗AV(pGap-empA),具有明顯的多效價免疫保護力，可作為鰻弧菌和嗜水氣單胞菌的活疫苗，並具有良好的應用甜景。權利要求1、一種重組質粒，其特徵在於，所述重組質粒包含鰻弧菌金屬蛋白酶信號肽和3-磷酸甘油脫氫酶的融合基因序列和載體序列，其中所述鰻弧菌金屬蛋白酶信號肽介導所述3-磷酸甘油脫氫酶的分泌。2、如權利要求1所述的重組質粒，其特徵在於，所述3-磷酸甘油脫氫酶來源於嗜水氣單胞菌。3、如權利要求2所述的重組質粒，其特徵在於，所述嗜水氣單胞菌保藏號為CCTCCNo:M209124。4、如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述載體為pUC18質粒。5、如權利要求14中任一項所述的重組質粒的製備方法，其特徵在於，所述方法包括A)構建信號肽-3-磷酸甘油脫氫酶融合基因；B)酶切融合基因和載體；C)將酶切的融合基因和酶切的載體進行連接。6、一種多效價活疫苗，其特徵在於，所述多效價活疫苗由權利要求14中任一項所述的重組質粒轉化鰻弧菌減毒株獲得。7、如權利要求6所述的多效價活疫苗，其特徵在於，所述鰻弧菌減毒株為保藏號為CCTCCM204066的菌株。8、如權利要求6或7所述的多效價活疫苗的製備方法，其特徵在於，所述方法包括A)構建如權利要求14中任一項所述的重組質粒；B)將歩驟A)獲得的重組質粒轉化鰻弧菌減毒株。9、如權利要求8所述的製備方法，其特徵在於，所述方法還包括在步驟B後進行陽性克隆株篩選的歩驟。10、如權利要求6或7所述的多效價活疫苗的應用，其特徵在於，所述應用為用於預防鰻弧菌和嗜水氣單胞菌導致的魚類疾病。全文摘要本發明提供了一種重組質粒、多效價活疫苗及其製備方法和應用。本發明提供的重組質粒包含鰻弧菌金屬蛋白酶的信號肽和嗜水氣單胞菌3-磷酸甘油脫氫酶的融合基因序列；製備方法包括A)構建信號肽-3-磷酸甘油脫氫酶融合基因；B)酶切融合基因和載體；C)連接酶切的融合基因和載體。多效價活疫苗由重組質粒轉化鰻弧菌減毒株獲得；其製備方法包括A)構建包含鰻弧菌金屬蛋白酶的信號肽和嗜水氣單胞菌3-磷酸甘油脫氫酶的融合基因的重組質粒；B)將步驟A)獲得的重組質粒轉化鰻弧菌減毒株；其應用為用於預防鰻弧菌和嗜水氣單胞菌導致的魚類疾病。使用本發明提供的減毒疫苗，具有明顯的多效價免疫保護力，可作為鰻弧菌和嗜水氣單胞菌的活疫苗，並具有良好的應用前景。文檔編號C12N15/63GK101659958SQ20091005411公開日2010年3月3日申請日期2009年6月30日優先權日2009年6月30日發明者琴劉,周凌雲,張元興,王啟要申請人:華東理工大學