基於顏色的逆轉錄等溫擴增技術檢測腸道病毒基因組5』-utr的製作方法
2023-05-20 03:35:06
基於顏色的逆轉錄等溫擴增技術檢測腸道病毒基因組5』-utr的製作方法
【專利摘要】本發明屬於生物技術應用領域，涉及各級疾病預防控制機構，手足口病檢測網絡實驗室，哨點醫院等用於對手足口病疑似病患咽拭子、肛拭子、腦脊液、皰疹液、糞便等標本的腸道病毒感染的檢測和監測。具體是應用基於顏色的逆轉錄等溫擴增技術(RT-GEAR)，通過計算機軟體分析腸道病毒基因組5』-UTR的保守序列，分別設計出四條引物完全與識別基因靶序列中五個結合區匹配，並於反應前加入HNB(羥基萘酚藍)染料，只需一步就可完成在63℃等溫環境中擴增1小時，最後用肉眼觀察染料顏色變化和管底的白色沉澱判定檢測結果，與傳統的病毒分離、血清學檢測、RT-PCR方法等比較，它具有更安全、特異、靈敏、便捷的優勢。
【專利說明】基於顏色的逆轉錄等溫擴增技術檢測腸道病毒基因組 5, -UTR 發明領域
[0001] 本發明是用基於HNB顏色的逆轉錄等溫擴增技術（Reverse transcription isothermal genome exponential amplification reaction,RT-GEAR)檢測人感染腸道病 毒基因組5'端非翻譯區（5' -Untranslated region，5' -UTR)。用於各級疾病預防控制機 構，手足口病檢測網絡實驗室，哨點醫院對人感染腸道病毒的檢測和監測。
[0002] 發明背景
[0003] 腸道病毒感染廣泛分布於全球各地，人的一生中往往會經歷多次感染。腸道病毒 可直接引多種疾病，如手足口病、脊髓灰質炎、無菌性腦膜炎、皰疹性咽峽炎、結膜炎、流行 性肌痛、甲型肺炎等。2008年以來，由腸道病毒引起的手足口病出現大規模流行，發病人數 呈快速上升趨勢,範圍遍及全國，引起國家和社會的廣泛關注。
[0004] 手足口病（Hand-foot-mouth Disease，HFMD)是由多種人腸道病毒引起的一種兒 童常見傳染病，是我國法定報告管理的丙類傳染病。大多數患者症狀輕微，以發熱和手、足、 口腔等部位的皮疹或皰疹為主要症狀。少數患者可出現無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻 痺、神經源性肺水腫和心肌炎等，個別重症患兒病情進展快，可導致死亡。引起手足口病的 病毒屬於小RNA病毒科腸道病毒屬，包括柯薩奇病毒A組、柯薩奇病毒B組、腸道病毒71型 (Enterovirus71，EV71)、埃可病毒等18種腸道病毒血清型。
[0005]為有效阻止疫情的爆發和發生疫情後的應急處置，根據衛生部應對手足口疫情防 控要求，我國已決定在各地增加病毒檢測實驗室和哨點醫院，擴大監測網絡的覆蓋範圍。將 網絡實驗室擴大到整個地市一級，目標是使全國300多個地市都具備能夠進行病毒檢測的 能力，及早發現可能出現人傳人病例，切實做到早發現、早報告、早處置。本專利成功建立的 基於HNB顏色的逆轉錄等溫擴增技術檢測人感染腸道病毒基因組5'-UTR方法，將為提高我 國疾病監測網絡實驗室和哨點醫院的監測能力，實現對手足口病人的快速篩查提供了有力 的技術保障。
[0006]基於HNB顏色的逆轉錄等溫擴增技術（RT-GEAR)在RNA病毒的檢測方面應該有著 傳統基因診斷方法無法比擬的優勢，與一些常規的基因檢測手段相比，該技術在可操作性 和檢測時間及設備要求方面具有更大的優勢。這主要體現在以下幾個方面。首先，它的檢 測時間可以縮短到1小時以內，靈敏度可達到檢測1000個拷貝以上的病毒核酸分子。除了 應用一些常用聚合酶外，對硬體設備基本無特殊要求，在普通的生物實驗室就可完成這項 檢測工作。在試驗實施中只需一步就可完成實驗操作,減少了汙染機會並方便了實驗過程 中的質控工作。第二，該技術省略了單獨的逆轉錄和巢式PCR的二次擴增步驟，加之擴增反 應在 63°C等溫條件下進行，沒有核酸的變復性過程，不但節省了大量的時間又減少了 RNA 酶和擴增核酸的汙染機會。第三，擴增反應只有在四條引物完全與識別的靶序列中五個結 合區匹配的情況下才能順利進行，所有這些特性都在很大程度上減少了擴增反應的背景， 從而使檢測特異性得到改善。第四，RT-GEAR的擴增反應中可以形成可視的焦磷酸鎂白色 沉澱，HNB染料在擴增前加入，因此肉眼也可觀察到陽性反應管中的白色混濁物和反應管內 顏色的變化，可以直接判定檢測結果。
【發明內容】
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[0007] 1.本發明是對目前對RNA病毒檢測技術手段的改進和補充，它具有安全、特異、靈 敏、便捷的優勢。這主要體現在以下幾個方面。首先，檢測時間短靈敏度高。整個檢測時間 可縮短至1小時內，靈敏度可與實時螢光定量PCR媲美。其次，特異性高。所設計的四條特 異性引物，只在其與識別靶序列中五個結合區完全匹配的情況下擴增才能順利進行。然後， 所有的擴增過程都可在63°C等溫下完成，無需PCR儀，降低了對實驗硬體的要求。最後，汙 染機會低和結果可視化。。
[0008] 2.選擇腸道病毒基因組5'-UTR(Untranslated region，非翻譯區）的相對保守區 設計相應的RT-GEAR引物，針對每個基因分別包括兩條嵌合引物（FT、BT)和兩條加速引物 (IF、IR)。所有引物的具體序列見表1。
[0009] 表1 :逆轉錄等溫擴增技術檢測腸道病毒基因組5' -UTR的引物序列
[0010]
【權利要求】
1. 一種用於腸道病毒感染的檢測，基於HNB(羥基萘酚藍）顏色的逆轉錄等溫擴增技術 (RT-GEAR)，其中包括：用於腸道病毒基因組5' -UTR(Untranslated Region，非翻譯區）檢 測的4條寡核苷酸引物和HNB(羥基萘酚藍）染料。所述引物序列為： panEV-FT ：5, -GTTAGGATTAGCCGCATTCAGGGGGTGTGAAGAGTCTATTGAGCT-3; panEV-BT ：5, -CCCTGAATGCGGCTAATCCTAACGAAACACGGACACCCAAA-3; panEV-IF :5' -GCCGGAGGACTACTAACT-3' panEV-IR:5' -GCAGCGGAACCGACTAC-3'。
2. 權利要求1所述的腸道病毒感染的檢測的逆轉錄等溫擴增技術（RT-GEAR)的引物所 列的基因序列及其每種序列的互補序列或變體。
3. 權利要求1所述的腸道病毒感染的檢測的逆轉錄等溫擴增技術（RT-GEAR)包括人感 染各型別腸道病毒及其變異株。
4. 權利要求3所述的本發明的應用範圍包括各級疾病預防控制機構，手足口病檢測網 絡實驗室，哨點醫院用於人感染腸道病毒基因組5' -UTR的檢測和監測。
5. 權利要求1所述的人感染腸道病毒基因組5' -UTR的檢測，基於HNB顏色的逆轉錄 等溫擴增技術（RT-GEAR)的反應程序和檢測程序。
【文檔編號】C12Q1/70GK104232788SQ201310248493
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月21日 優先權日:2013年6月21日
【發明者】馬學軍, 聶凱, 許文波, 張勇 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所