油茶ssr分子標記的製作方法
2023-05-20 08:59:26 2
油茶ssr分子標記的製作方法
【專利摘要】一種油茶SSR分子標記，包括油茶DNA序列的獲得及預處理、DNA序列中SSR位點的檢索、SSR引物的設計與合成、SSR標記體系的建立、多態性SSR標記的篩選。檢索利用454測序得到油茶基因組序列及EST序列中含有簡單序列重複單元的、符合條件的序列，篩選得到12個多態性豐富的SSR標記CO_gSSR11、CO_gSSR12、CO_gSSR14、CO_gSSR16、CO_gSSR19、CO_gSSR20、CO_eSSR01、CO_eSSR04、CO_eSSR16、CO_eSSR40、CO_eSSR44、CO_eSSR48。本發明適用於油茶種質資源的遺傳評價、種質鑑定及分子標記輔助育種研究，重複性好、可靠性高，是一種非常有效的分子標記。
【專利說明】油茶SSR分子標記
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種DNA分子標記技術，具體涉及為油茶微衛星遺傳標記的開發技術，適用於油茶的遺傳多樣性研究，種質鑑定和親緣關係分析。
【背景技術】
[0002]微衛星(MiciX)Satel I He )是指廣泛散布於基因組中的以少數幾個核苷酸(多數為2-4個)為單位的多次串聯重複的DNA序列，人們稱之為簡單重複序列(Simple sequencer印eats，SSR)，是基因組中變異率相對較高一類DNA序列。近些年來，SSR已經成為最流行的遺傳標記。作為檢測效率較高的共顯性標記，SSR標記集中了其它分子標記的優點，如典型的共顯性和多等位基因，具備高的多態性，能準確區分親緣關係非常相近的個體；DNA的用量少，擴增結果的重現性高，可以有效地實現簡單，快速的PCR操作，同時基因型可通過瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯醯胺凝膠電泳分析，也可通過引物的螢光標記進行自動分析。但是，SSR標記的開發依賴於擁有大量的DNA序列基礎，而在以往，傳統的微衛星開發途徑主要通過構建基因組文庫，費時耗力並且效率不高，局限了微衛星的運用。隨著植物基因組學及生物信息學的發展，大規模基因測序技術日新月異，第二代以454測序為標誌的測序技術更是推動了高通量基因組測序時代的來臨。利用微衛星搜索工具從基因測序得到的大量DNA序列中查找微衛星，已然成為開發微衛星標記最為便捷、有效的方式。目前已在如松柏類樹種、楊柳科樹種、桉樹、殼鬥科樹種及大部分薔薇科樹種等許多林木中開發並應用微衛星標記，並廣泛的運用於指紋分析、構建遺傳連鎖圖譜、群體遺傳結構和進化分析研究。
[0003]油茶(Camellia oleifera)稱之為東方的橄欖樹而聞名於世，與油棕、油橄欖和椰子並稱為世界四大木本食用油料樹種。油茶主產品茶油是優質高級食用油，其成分以油酸和亞油酸為主的不飽和脂肪酸含量在90%以上，易於人體吸收，耐貯藏，不易酸敗，且色美味香，深受人民的喜愛。目前油茶優樹在全國範圍內集中決選，各主產區間存在相互引種栽培的普遍現象，這就導致油茶各無性系的自然地域性特徵不強，油茶良種、無性系及地方農家品種等相互混雜在所難免，採用有效的分子標記在遺傳學角度開展油茶品種真實性的分子甄別在生產應用中變的尤為迫切；而為了研究油茶遺傳變異規律，同時從大量的油茶遺傳資源中選育並豐富油茶良種，開展油茶分子標記輔助育種也是其行之有效的方法。當前油茶育種工作者廣泛採用的分子標記為現有的通用型分子標記，如RAPD、ISSR等均為顯性標記，存在重複性差的嚴重缺陷，及共遷移的缺點。與其它分子標記相比，SSR標記數量豐富，基因組覆蓋度 高，呈現多基因特點，信息含量高，表現為共顯性遺傳，重複性好，且SSR分析對DNA數量及純度要求不高。然而迄今，油茶微衛星分子標記的開發利用研究甚少，國內只有少量利用茶樹微衛星標記引物隨機擴增油茶基因組的報導(劉冰等，油茶SSR-PCR反應體系建立與優化.安徽農業大學學報，2011，38(6):858-862)，此外除溫強等(Wen Q etal.Development of polymorphic microsatellite markers in Camellia chekiangoleosa (Theaceae)，American Journal of Botany，2012，5 (I): e203_e205.)利用油荼類物種浙江紅花油荼的EST序列開發了 18對浙江紅花油荼的SSR標記外，未見利用油荼DNA序列開發油茶SSR標記的報導。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是針對現有技術尚未利用油茶DNA序列開發油茶微衛星標記的現狀，利用454測序技術獲得普通油茶基因組序列與EST序列，應用生物信息學方法，開發出油茶微衛星分子標記，建立油茶微衛星的技術體系，並應用於油茶優良高產無性系的遺傳多樣性研究及DNA指紋圖譜構建。
[0005]為了實現上述目的，本發明的技術方案為:
[0006]( I)所述油茶SSR分子標記特徵包括:微衛星分子標記編號、微衛星分子標記所對應的核苷酸序列、微衛星分子標記所對應的12個位點的引物序列；
[0007]所述的微衛星標記編號為:C0_gSSRll、C0_gSSR12、C0_gSSR14、C0_gSSR16、C0_gSSR19、C0_gSSR20、C0_eSSR01、C0_eSSR04、C0_eSSR16、C0_eSSR40、C0_eSSR44、C0_eSSR48 ；
[0008]所述微衛星分子標記所對應的核苷酸序列分別為:
[0009]
【權利要求】
1.一種油荼SSR分子標記，其特徵包括:微衛星分子標記編號、微衛星分子標記所對應的核苷酸序列、微衛星分子標記所對應的12個位點的引物序列； 所述的微衛星標記編號為:C0—gSSRll、CO—gSSR12、C0—gSSR14、C0—gSSR16、C0—gSSR19、CO—gSSR20、CO—eSSROl、CO—eSSR04、CO—eSSR16、CO—eSSR40、CO—eSSR44、CO—eSSR48 ； 所述微衛星分子標記所對應的核苷酸序列分別為:
2.根據權利要求1所述油茶SSR標記體系特徵包括:PCR反應體系和PCR反應程序。PCR反應體系:10μ I中含IOXPCR緩衝液I μ 1，Mg2 + 2.5mM, dNTPs200 μ M，上下遊引物各0.2 μ M，Taq聚合酶1U，DNA30ng左右； PCR 反應程序:94°C預變性 5min ；94°C, 30s, Ta, 30s, 72°C, 30s, 30 個循環；最後 72。。延伸lmin，8度保存。各引物對應的退火溫度Ta詳見下表:
【文檔編號】C12Q1/68GK103667275SQ201310681868
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月13日 優先權日:2013年12月13日
【發明者】溫強, 劉麗婷, 徐立安, 徐林初, 周文才, 葉金山, 朱恆, 黃敏仁 申請人:江西省林業科學院