一種雷莫拉寧的純化方法

2023-05-20 00:47:31

專利名稱：一種雷莫拉寧的純化方法
技術領域：
本發明涉及抗生素雷莫拉寧的製備，特別涉及一種雷莫拉寧的純化方法。
背景技術：
雷莫拉寧(Ramoplanin，A/16686)提純的傳統方法是通過常規前處理步驟用鹽酸將產生雷莫拉寧菌株，如Actinoplanes sp.ATCC 33076的發酵產物調pH至3.5，分離得到菌絲體和發酵液。其中菌絲體用有機溶劑，如甲醇等低級醇或氯仿等提取，得到含有目的物的粗提液，真空濃縮得到漿狀物，即雷莫拉寧的粗提液濃縮物，再用正丁醇萃取多次，合併萃取液後，再反覆用石油醚析出沉澱並分離其，真空乾燥得到粗品；而發酵液也用正丁醇萃取，然後用同樣方法製得粗品。該粗品反覆用混合溶劑氯仿∶乙醇∶水(體積比4∶7∶2)處理，得到油狀物，加水結晶並固液分離，得到的固體和液體還需不同溶劑多步處理後，得到較純的粗品再溼法上矽膠柱純化；例如上述的固體用不同的有機溶劑(如甲醇、正丁醇、乙醚等)反覆處理，得到較純的粗品後再溶於乙腈與水的混合物，然後溼法上矽膠柱，用不同溶劑(乙腈與水混合物，以及乙腈與0.1N鹽酸混合物)作為流動相洗柱子，用薄層色譜法檢測，收集目的洗脫液(USP 4328316)。可見其過程複雜，有機溶劑使用量很大，汙染嚴重，且由於萃取次數多，造成損失而收率低。

發明內容
本發明要解決的技術問題是克服上述現有技術中的缺陷，提供一種步驟簡化、明顯減少有機溶劑使用量的雷莫拉寧的純化方法。
本發明通過下列技術方案來解決上述技術問題。一種雷莫拉寧的純化方法，其包括將雷莫拉寧的粗提液濃縮物先與部分矽膠混合，揮幹溶劑，再將得到的固體混合物置於以矽膠為填充物的柱子上端進行柱層析，其中依次用丙酮、甲醇水溶液、以及甲醇與酸水的混合物作為流動相。
其中，該甲醇與酸水的體積比較佳地為1∶4～4∶1。甲醇含量太高或者太低的話，雷莫拉寧和其他的雜質分離效果不明顯。所說的酸水選自鹽酸，硫酸、醋酸和磷酸等；通常選用其稀溶液，其濃度優選為0.01mol/l～1mol/l。
而該甲醇水溶液中甲醇與水的體積比優選1∶4～4∶1。甲醇比例太低的話，有些雜質洗脫速度慢；反之，甲醇比例太高，有些雜質也不容易洗脫下來。
更佳地，該矽膠柱中粗提液濃縮物(未揮發溶劑前)佔其與矽膠總重量的百分比不超過10％，超過以後，多餘量的產物無法被吸附，從而會被開始的丙酮溶劑洗脫下來，無法達到分離的目的。該百分比更佳地為3～8％(根據實施例改的)。而粗提液濃縮物先與部分矽膠混合時，「部分矽膠」的用量是指能夠將粗提液濃縮物完全混合吸附後便於上柱的量，大約是和粗提液濃縮物等量就可以了，一般不會超過3倍。
而本發明所說的雷莫拉寧的粗提液濃縮物可根據現有技術製備，如參照上述專利文獻所公開的有關內容。本發明選用下列具體步驟製得將產生雷莫拉寧菌株，如ATCC33076的發酵產物用酸調pH至3.5，離心得到菌絲體和發酵液；其中菌絲體再用極性有機溶劑浸泡半小時以上，然後離心得到上清液，濃縮至漿狀物即得該雷莫拉寧的粗提液濃縮物。
當然，根據上述專利文獻所知，本發明的雷莫拉寧的粗提液濃縮物也可將發酵液直接濃縮至漿狀物製得。
其中，所述的酸優選草酸，所述的極性有機溶劑為甲醇或乙醇。
利用上述本發明的幹法矽膠柱純化方法，可分部收集上述不同流動相的流出液，HPLC跟蹤檢測，收集目的物含量達到85％以上的流出液，濃縮至幹得到雷莫拉寧。則純度達到85％以上，而收率達到90％以上。可見，本發明純化方法步驟簡單，有機溶劑使用量明顯減少，並具有較高的收率和純度。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明並不受其限制。
下面實施例中所用的雷莫拉寧的粗提液濃縮物選用下列步驟製得參照現有技術，如上述美國專利文獻的例1發酵培養ATCC 33076菌株，然後發酵產物用草酸調pH至3.5，離心得到菌絲體，再用極性有機溶劑甲醇或乙醇(1L/kg菌絲體)浸泡菌絲體半小時以上，然後離心得到上清液，濃縮至漿狀物(通常體積為上清液的1/10～1/20)即得該雷莫拉寧的粗提液濃縮物。
其中下列實施例中的收率由純化得到的雷莫拉寧/上述上清液(w/w)計算得到。
實施例1取雷莫拉寧的粗提液濃縮物5g，與5g矽膠攪拌混合，揮幹溶劑，再將得到的固體混合物置於以50g矽膠為填充物的柱子的上端(柱高×直徑20cm×3cm)，分別用丙酮，甲醇與水(v/v，1∶4)的混合物，以及甲醇與0.1mol/l的鹽酸水溶液(v/v，1∶4)混合物作為流動相，流速1ml/min，分部收集流出液，採用常規HPLC跟蹤檢測(方法同現有技術USP 4427656)，收集目的物含量達到85％以上的流出液，濃縮至幹得到純化的雷莫拉寧。收率為93％，純度達到85％。
實施例2取雷莫拉寧的粗提液濃縮物5g，與7.5g矽膠攪拌混合，流動相中甲醇與水體積比為4∶5，甲醇與酸水(0.5mol/l的硫酸)的體積比為4∶5，餘同實施例1。製得雷莫拉寧收率為94％，純度達到89％。
實施例3
取雷莫拉寧的粗提液濃縮物3g，與5g矽膠攪拌混合，流動相中甲醇與水體積比為4∶1，甲醇與酸水(1mol/l的醋酸)的體積比為4∶1，餘同實施例1。製得雷莫拉寧收率為93％，純度達到87％。
實施例4取雷莫拉寧的粗提液濃縮物2g，與4g矽膠攪拌混合，流動相中甲醇與水體積比為2∶1，甲醇與酸水(0.01mol/l的磷酸)的體積比為2∶1，餘同實施例1。製得雷莫拉寧收率為92％，純度達到86％。
上述實施例中柱層析用矽膠(200～300目)，青島海洋化工廠產品，餘試劑均為常規市售產品。
權利要求
1.一種雷莫拉寧的純化方法，其包括將雷莫拉寧的粗提液濃縮物與部分矽膠混合，揮幹溶劑，再將得到的固體混合物置於以矽膠為填充物的柱子上端進行柱層析，其中依次用丙酮、甲醇水溶液、以及甲醇與酸水的混合物作為流動相。
2.如權利要求1所述的純化方法，其特徵在於該甲醇與酸水的體積比為1∶4～4∶1。
3.如權利要求1或2所述的純化方法，其特徵在於所說的酸水選自鹽酸，硫酸、醋酸和磷酸。
4.如權利要求3所述的純化方法，其特徵在於該酸水濃度為0.01mol/l～1mol/l。
5.如權利要求1所述的純化方法，其特徵在於該甲醇水溶液中甲醇與水的體積比為1∶4～4∶1。
6.如權利要求1所述的純化方法，其特徵在於該矽膠柱中粗提液濃縮物佔其與矽膠總重量的百分比不超過10％。
7.如權利要求1所述的純化方法，其特徵在於該雷莫拉寧的粗提液濃縮物可由下列步驟製得將產生雷莫拉寧菌株的發酵產物用酸調pH至3.5，離心得到菌絲體和發酵液；其中菌絲體再用極性有機溶劑浸泡半小時以上，然後離心得到上清液，濃縮至漿狀物；或者將發酵液直接濃縮至漿狀物即得該雷莫拉寧的粗提液濃縮物。
8.如權利要求7所述的純化方法，其特徵在於所述的酸為草酸，所述的極性有機溶劑選自甲醇和乙醇。
全文摘要
本發明公開了一種雷莫拉寧的純化方法，其包括將雷莫拉寧的粗提液濃縮物與部分矽膠混合，揮幹溶劑，再將得到的固體混合物置於以矽膠為填充物的柱子上端進行柱層析，其中依次用丙酮、甲醇水溶液、以及甲醇與酸水的混合物作為流動相。本發明的提純方法步驟簡單，有機溶劑使用量明顯減少，並具有較高的收率和純度。
文檔編號C07G11/00GK101024662SQ20061002415
公開日2007年8月29日 申請日期2006年2月24日 優先權日2006年2月24日
發明者李繼安, 徐斌 申請人:上海醫藥工業研究院