馬鈴薯早疫病菌檢測試劑盒及檢測方法
2023-05-20 07:00:06
馬鈴薯早疫病菌檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明屬於植物病原真菌的種類分子鑑定【技術領域】，目的是提供一種基於聚合酶鏈式反應（PCR）技術的簡便、快速和準確鑑定馬鈴薯葉片組織中早疫病菌的檢測試劑盒和檢測方法。檢測試劑盒包括一對自行設計的專一性PCR引物和Mix，一對引物序列為：AsF：5'-CACCTCCCGGGGTGGCCA-3'，AsR：5'-CCCGCAAGGGGAGACAAA-3'。檢測過程如下：提取葉片或菌絲DNA，用專一性引物對AsF和AsR進行PCR擴增；瓊脂糖凝膠電泳分析是否專一性出現一條358bp條帶；通過擴增條帶的有無，即可判斷供試樣品是否為馬鈴薯早疫病菌。該技術有效解決了馬鈴薯早疫病田間早期診斷和分離物不產孢而造成的種類難以鑑定的難題，實現了對早疫病的早期診斷和檢測，也可用於科研人員對未產孢的早疫病病菌分離物進行分子鑑定提供技術支撐。
【專利說明】馬鈴薯早疫病菌檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物病原菌真菌的種類分子鑑定【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 馬鈴薯早疫病由爺鏈格孢[Wtemaria Sorauer (Ellis)]引起，該 病害可危害馬鈴薯葉片、地上莖和地下薯塊，屬世界性病害，一般年份給馬鈴薯引起的損失 在5-78%之間，嚴重地區也可造成絕收。馬鈴薯早疫病的早期診斷對於該病的防控具有重 要意義，而早期被早疫病菌侵入的葉片和組織症狀發展緩慢，並且不明顯，易與其它病害混 淆，而從這些被侵染組織中分離獲得的早疫病病菌絕大多數不產孢，對其種類很難鑑定，而 早疫病病菌體外誘導產孢周期長且工作量大，很難適應對早疫病田間檢測和不產孢分離物 的種類鑑定的需求。然而，隨著近年來測序技術的飛速發展，GenBank中積累了大量可用於 茄鏈格孢ITS序列，該序列由於進化速率較快、多拷貝適合於真菌分子鑑定的需要。我們從 GenBank中下載1672條爺鏈格孢屬種類的ITS序列，經過序列比對和分析，設計出了對馬鈴 薯早疫病菌具有專一性的引物對，通過PCR技術可對馬鈴薯葉片組織中的早疫病菌和未產 孢的純培養分離物進行準確的分子鑑定，發明了一套早疫病菌檢測試劑盒。該試劑盒可用 於我國農業系統各級植保部門、種薯企業以及馬鈴薯噴灌圈大種植戶對早疫病的早期診斷 和檢測，也可用於科研人員對未產孢的早疫病病菌分離物進行分子鑑定。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一種快速、準確鑑別馬鈴薯早期感染早疫病的試劑盒和診斷 方法，包括一對自主設計的特異性PCR引物對和Mix，以及整套PCR鑑定程序和步驟。
[0004] 1.本發明的技術方案如下：首先從GenBank中下載了鏈格孢屬的ITS序列1672 條，利用BioEdit和Clustal X軟體對其進行序列分析，得到茄鏈格孢的特徵DNA鹼基序列， 針對茄鏈格孢與其它種類鏈格孢DNA序列的差別，設計特異性引物對。通過PCR擴增、瓊脂 糖凝膠電泳，根據是否有預期長度358 bp相同條帶來判定該樣品是否被早疫病菌侵染或該 菌株是否為早疫病菌，通過比較同批樣品條帶的明暗也可對其進行含量多少的估計。對需 鑑定早疫病標樣或菌絲，提取總DNA，在給定的條件下，利用自行設計的專一性引物對AsF 和AsR進行PCR擴增，擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，被馬鈴薯早疫病菌感染的葉 片或未產孢的茄鏈格孢能擴增出一條長度為358bp的DNA條帶，而其他菌及陰性對照均未 能擴出預期的條帶。當供試樣品經本法進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有358bp 的DNA片段出現，便可準確鑑別瓊脂糖凝膠電泳結果。
[0005] 2.本發明設計的用於鑑別馬鈴薯早期感染早疫病的診斷方法和馬鈴薯上分離的 未產孢茄鏈格孢分子鑑定方法是採用以下步驟： (1) 菌絲或帶菌葉片DNA的提取； (2) 擴增DNA片段，即進行聚合酶鏈式反應，用於聚合酶鏈式反應的一對引物的DNA序 列為：
【權利要求】
1. 一種馬鈴薯早疫病菌(茄鏈格孢）的檢測試劑盒，其特徵在於：試劑盒包括一對特異 性引物DNA序列和Mix。
2. 如權利要求1所述的馬鈴薯早疫病菌(茄鏈格孢）的檢測試劑盒，其特徵在於：一對 特異性引物 DNA 序列，為：AsF:5'-CAC CTC CCG GGG TGG CCA-3' 和 AsR:5'-CCC GCA AGG GGA GAC AAA-3,。
3. 如權利要求1所述的馬鈴薯早疫病菌(茄鏈格孢）的檢測試劑盒，其特徵在於：試 劑盒 Mix 的成分為 Taq 酶（0· 1-0. 5 U/ μ L)、dATP (0· 05-0. 10 mM)、dTTP (0· 05-0. 10 mM)、dGTP(0. 05-0. 10 mM)、dCTP(0. 05-0. 10 mM)、MgCl2(0. 5-1. 0 mM)、KC1 (100-150 mM)、 Tris-HCl (20-25 mM, pH 9. 0-9.3)、1% Triton X-100 及穩定劑。
4. 如權利要求1所述的馬鈴薯早疫病菌(茄鏈格孢）的檢測試劑盒，其特徵在於：試劑 盒的檢測方法為：自待鑑定物上提取基因組DNA，利用自行設計的特異性引物進行聚合酶 鏈式反應（PCR)，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳後呈現專一大小的條帶。
5. 如權利要求4所述的馬鈴薯早疫病菌(茄鏈格孢)的檢測試劑盒檢測方法，其特徵在 於PCR擴增產生的條帶長度為358 bp。
6. 如權利要求1所述的馬鈴薯早疫病菌(茄鏈格孢）的檢測試劑盒，其特徵在於該方 法既可以用於菌絲鑑定，也可用於早疫病發病早期症狀不明顯的葉片中早疫病菌的分子鑑 定。
7. 如權利要求4所述的馬鈴薯早疫病菌(茄鏈格孢）的檢測試劑盒，其特徵在於利用 PCR擴增基因組DNA的檢測極限濃度為0. 5-1. 5 ng/ μ 1。
8. 如權利要求4所述的馬鈴薯早疫病菌(茄鏈格孢）的檢測試劑盒，其特徵在於：聚合 酶鏈式反應（PCR)的各階段反應條件為： 起始變性階段：95°C、lmin ; 變性階段：95°C、25-35s ; 復性階段：50°C、25-35s ; 延伸階段：72°C、20-25s ; 循環次數：35個循環； 最後延伸階段：72°C、7-9 min。
【文檔編號】C12Q1/04GK104120170SQ201310145529
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月24日 優先權日:2013年4月24日
【發明者】朱傑華, 楊志輝, 徐進, 郭倩倩, 楊毅清, 耿碩, 張維宏, 崔亞婧 申請人:河北農業大學