一種C型肝炎治療用藥指導的多重基因檢測方法
2023-05-20 04:16:51 2
專利名稱：一種C型肝炎治療用藥指導的多重基因檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測方法，尤其是一種高通量、準確定量、靈活性強、成本低的一種C型肝炎治療用藥指導的多重基因檢測方法。
背景技術：
C型肝炎病毒(HCV)感染者中有超過70%發展成慢性C型肝炎，在10 20中有20% 50%進展成肝硬化，1% 2%發展成肝細胞肝癌，危害嚴重。C型肝炎的抗病毒治療是緩解和抑制肝硬化和肝癌的重要途徑。但抗HCV藥物昂貴，且對不同病情有不同用藥標準，因此需要檢測多種信息以輔助用藥治療。指導C型肝炎的用藥治療的信息主要有血清C型肝炎病毒RNA水平，C型肝炎病毒的基因型和人類相關單核苷酸多態性(SNP)。只有聯繫病毒亞型類別、病毒在體內的複製水平和患者的個體信息綜合分析，才能做到真正的對症下藥。目前，主流的檢測方法缺點是:技術成本昂貴、複雜:每個樣品需要一個晶片，成本大於Y1000/樣品，不利於大規模推廣；探針的合成與固定比較複雜，特別是製作高密度的探針陣列，是主要的限速步驟。不能精確定量，重複性差。靈敏度較低:晶片法需核酸量較大，一般須先做多重PCR擴增，由於引物較多，容易自身產生二聚體，髮夾結構，或由於Tm值不同，而導致擴增目的片段效率不同，進而影響檢測的靈敏度。對於不同亞型的混合感染較難分辨。由於晶片的種類較多，難以制定一個統一的質量控制標準。
發明內容
本發明的目的是提供一種高通量、準確定量、靈活性強、成本低的一種C型肝炎治療用藥指導的多重基因檢測方法。本發明採用如下技術方案:一種基於毛細電泳的C型肝炎治療用藥指導的多重基因檢測方法，包括如下步驟:(I)生產「C型肝炎治療用藥指導多重基因檢測試劑盒」；(2)採集患者血液樣品，並提取核酸；(3)以樣品核酸為模板進行反轉錄；(4)以反轉錄產物為模板進行PCR反應；
(5)以毛細電泳的方法分離樣品。優選地，所述步驟(3)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻後在一定溫度下孵育的子步驟。優選地，所述步驟(3)中的孵育溫度分別為48°C、42°C、95°C、4°C。優選地，所述步驟(4)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻後按一定溫度進行熱循環反應的子步驟。優選地，所述步驟⑷的子步驟中的熱循環溫度分別為94°C、60°C、70°C、4°C。優選地，所述步驟(5)包括製備GeXP遺傳分析儀樣品、準備分離液、毛細電泳分離樣品、結果分析的步驟。本發明的有益效果為:
1.採用雷射誘導螢光-PMT，具有超高靈敏度，重複性好。2.GeXP採用毛細管電泳對PCR產物進行分離檢測，可將精確分離一個鹼基數量差異的片段，能有效分辨出特異性產物，避免假陽性。3.高通量檢測:可以在一個反應當中同時檢測C型肝炎病毒的RNA水平和人類的SNP位點並檢測，即一個反應獲得三種用藥治療指導信息。4.精確定量:對病原體基因拷貝數的定量檢測有著與螢光定量PCR同樣的高精確性。5.靈活性強:可隨時根據需求增加或修改所需研究的SNP位點。6.成本低:每個樣品的檢測成本少於Y50，包括了C型肝炎病毒RNA定量檢測、人類SNP位點的檢測和感染病毒亞型多種信息，利於大規模推廣。
具體實施例方式下面根據實施例對本發明作進一步詳細說明。本發明創立了一種同步檢測C型肝炎病毒RNA水平、人類相關SNP位點和感染C型肝炎病毒亞型的多重基因檢測方案。檢測步驟(詳見第四節:具體實施方式
):採集患者樣品(血樣)，提取核酸，以之為模板進行反轉錄和PCR反應，最終用毛細電泳方法分離PCR產物。1.檢測目標主要1.)定量檢測樣品C型肝炎病毒RNA水平。參見表I2.)檢測與C型肝炎治療用藥相關的SNP位點:rsl2979860和rs8099917。3.)檢測C型肝炎病毒亞型:la、lb、2、2a、3a、3b、6共七種亞型。2.建立了可靠地樣品質量及反應過程的對照。參見表II)人DNA和人RNA完整性的對照內參:確保在檢驗過程中對樣品質量的判斷，避免假陰性。2)正常反應對照內參:監控PCR反應效率，避免假陰性。3.多重基因檢測 的引物設計。參見表2表I多重檢測目標
權利要求
1.一種C型肝炎治療用藥指導的多重基因檢測方法，包括如下步驟:(1)生產「C型肝炎治療用藥指導多重基因檢測試劑盒」；(2)採集患者血液樣品，並提取核酸；(3)以樣品核酸為模板進行反轉錄；(4)以反轉錄產物為模板進行PCR反應；(5)以毛細電泳的方法分離樣品。
2.根據權利要求1所述的 檢測方法，所述步驟(I)中的試劑盒包括:反轉錄引物管、PCR引物管、25mM氯化鎂、DNA聚合酶、陽性對照。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，所述步驟(3)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻後並在48 0C、42 0C、95 °C、4°C的溫度下孵育的子步驟。
4.根據權利要求1所述的檢測方法，所述步驟(4)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻後按一定溫度進行熱循環反應的子步驟。
5.根據權利要求4所述的檢測方法，所述步驟(4)的子步驟中的熱循環溫度分別為94。。、60。。、70。。、4。。。
6.根據權利要求1所述的檢測方法，所述步驟(5)包括製備GeXP遺傳分析儀樣品、準備分離液、毛細電泳分離樣品、結果分析的步驟。
全文摘要
本發明公開了一種C型肝炎治療用藥指導的多重基因檢測方法，包括如下步驟(1)生產「C型肝炎治療用藥指導多重基因檢測試劑盒」；(2)採集患者血液樣品，並提取核酸；(3)以樣品核酸為模板進行反轉錄；(4)以反轉錄產物為模板進行PCR反應；(5)以毛細電泳的方法分離樣品。本發明具有靈敏度高、重複性好、準確性強、靈活性強、成本低的優點。
文檔編號C12Q1/68GK103074417SQ20121020420
公開日2013年5月1日 申請日期2012年6月20日 優先權日2012年6月20日
發明者吳勇, 顏進 申請人:海爾施生物醫藥股份有限公司