氯代脂肪烴降解性質粒pRC11、工程菌及其應用的製作方法
2023-05-20 07:29:16 1
專利名稱：氯代脂肪烴降解性質粒pRC11、工程菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種氯代脂肪烴降解性質粒PRC11、含有該質粒的基因工程菌，以及該工程菌在微生物降解滷代烴類汙染物中的應用。
背景技術：
細菌降解性質粒在有機汙染物微生物降解過程中起重要作用，它們編碼了一些降解過程中的關鍵酶類，賦予細菌分解代謝各種複雜有機化合物的能力。迄今已報導的滷代烴降解性質粒主要以氯代芳香族化合物降解性質粒為多，如氯代苯甲酸降解質粒1^025、 Pac27和Pwrl，以及2，4-二氯苯氧基乙酸降解質粒？開4，pEML159和pRCIO等。國內關於有機汙染物降解性質粒的研究工作開展得比較晚，在80年代末才陸續有一些報導。迄今尚沒有氯代脂肪烴降解性質粒的報導。
發明內容
本發明目的是為了提供一種氯代脂肪烴降解性質粒——pRCll、含有該質粒的基因工程菌及其在微生物分解處理氯代有機汙染物中的應用。為達到發明目的本發明採用的技術方案是一種氯代脂肪烴降解性質粒pRCll，其物理圖譜見圖3，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。本發明質粒從實驗室自行建成的工業廢氣生物淨化微生物資源菌種庫中篩選獲得，命名為pRCll。本發明還涉及含有所述質粒pRCll的基因工程菌。本發明還涉及所述基因工程菌在微生物降解滷代烴汙染物中的應用。具體的，所述滷代烴汙染物優選為下列之一 CH2C12、CH2BrCl、C2H4Cl2或C2H2C12。優選的，所述降解在28 32°C、pH6. 8 7. 2下進行。本發明提供了一種滷代脂肪烴降解性質粒pRCll，並建立了質粒的物理圖譜，對今後利用該質粒進行分子育種，培育高效多功能質粒菌，消除有關物質的環境汙染創造了條件。本發明的有益效果主要體現在提供一種氯代脂肪烴降解性質粒——pRCll，建立了質粒的物理圖譜，該質粒遺傳背景非常清晰，可利用該質粒進行分子育種，培育高效多功能質粒菌，提高以二氯甲烷為代表的滷代烴類有機汙染物的生物降解效果，大幅度提高有機廢氣的處理能力。
圖1為氯代脂肪烴降解性質粒——pRCll電泳檢測圖譜；圖2為質粒pRCll利用Bam HI、Eco RI、HindIII限制性酶切圖譜；圖3為pRCll和pJP4物理圖譜比較；
圖4陽性轉化子E. coli DH5 (dcm+)對不同滷代烷烴的降解特性。 具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例1 質粒pRCll的獲得及鑑定1)質粒檢測(1) 3mL LB菌液培養過夜，7000轉/分4°C離心10分鐘；(2)重懸於1 mLTE緩衝液中(40mM Tris-乙酸，2mM EDTA，用冰乙酸調整pH值為 7. 9)；(3)加入 2mL 裂解液(3% SDS, 50mM Tris,加 1. 6mL2N NaOH 調整 pH 為 12. 6)裂解，輕搖混勻(4)在50 65°C的水浴中加熱20分鐘，然後加入2倍體積的氯仿；(5)輕輕振蕩乳化，離心破乳(6000轉/分，15分鐘，40°C )；(6)上清液直接進行電泳分析。用瓊脂糖凝膠電泳分析質粒帶，條件如下瓊脂糖濃度0. 7%，電泳電壓80V，電泳緩衝液TBE，marker為λ DNA/HindIII，採用凝膠成像儀分析電泳結果(結果見圖1)。2)質粒的提取採用鹼法提取質粒。(1)取過夜培養的菌液1. 5mL於微量離心管中，用微量離心以最大轉速Vmax離心 3 4s，棄上清，用吸水紙吸乾。(2)菌體中加入鹼裂解液I 100 μ L，劇烈振蕩充分懸浮菌體。(3)加入200 μ L新鮮配置的鹼裂解液II，快速柔和顛倒數次，以混合內容物。(4)加入經冰預冷的鹼裂解液III 150 μ L,置於冰上5min。(5) Vmax離心5min，取上清，轉移至另一新的離心管中，重複該步驟一次。(6)加入等體積的酚氯仿(1 1)，劇烈振蕩。(7)Vmax離心2min，用移液槍吸出上清，注意中間層蛋白不要吸出來。(8)加入2倍體積無水乙醇(約ImL)，室溫放置2min，Vmax離心5min，棄上清。(9)加入ImL 75%乙醇，將微量離心管顛倒數次，Vmax離心2min，棄上清，用吸水紙洗幹，不夠幹可以離心後用移液槍吸去餘液，室溫放置2 3min，直至試管內沒有可見的液體存在。(10)加入30 μ L含有去DNA酶的RNA酶Μ20 μ g/mL)的超純水或TE溶液重新溶解核酸，貯存於_20°C。溶液I :50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)，IOmM EDTA (ρΗ8· 0)；溶液II IOM NaOH 60 μ L, 10% SDS 300 μ L, dd H2O 2640 μ L 總體積 3000 μ L 或 IOM NaOH 20 μ L，10% S DS 100 μ L, dd H2O 880uL 總體積 1000 μ L ；溶液III :3M NaAc (ρΗ4· 8)無水 NaAc 26. 4g 用 70mL ddH20 溶解，用約 20mL 冰乙酸調pH至4. 8，定容至100mL。3)質粒的消除採用丫啶橙消除法。
挑單菌落於3mL LB培養基(含氨苄50yg/mL)中，30°C搖床過夜培養，然後取 200 μ L菌液，接入5mL LB培養基(含丫啶橙75mg/L)，30°C搖床培養M小時，然後稀釋後， 塗布至以下四個平板①LB平板；②LB平板(含氨苄50yg/mL)；③LB平板(含硝基苯 100mg/L)；④LB平板(含氨苄50 μ g/mL和硝基苯100mg/L)，培養2_3天，檢查菌落在平板上的生長情況。4)質粒的轉化感受態細胞的製備用接種環挑取甘油保存的DH5 α菌種在LB瓊脂平板上劃線培養。取瓊脂平板上一個單菌落，接種到5mL LB培養基中，37°C振蕩培養，至0D_ = 0.3 0.4時，將培養管冷卻至0 4°C。取若干滅菌的1.5mL離心管，各加入200 μ L菌液。再各加入過濾除菌的4mol/L CaCl25yL，加上蓋，輕彈管底使混勻。即製得感受態菌。質粒轉化在感受態細胞中加入5 μ L質粒溶液(DNA ^ IOng)，輕彈離心管底部， 使質粒與細菌混勻。0 4°C冰浴中靜置30min。在42°C水浴中，安靜放置90 120s。冰浴1 aiiin。37°C，振蕩培養45min。將離心管中全部菌液，鋪到含相應抗生素的LB瓊脂平板上。在37°C溫箱中，倒置培養過夜。菌落計數、擴增、鑑定。陽性轉化子E. coli DH5 (dcm+)能在16mmol/L的無機鹽匪培養基中生長良好，而質粒消除後的E. coli DH5(dcm_)又不能以DCM為碳源生長。E. coli DH5陽性轉化子培養 72h的二氯甲烷生物降解效率見表1。表1 大腸桿菌E. coli DH5陽性轉化子培養72h的二氯甲烷生物降解效率
權利要求
1.一種氯代脂肪烴降解性質粒pRCll，其物理圖譜見圖3，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.含有權利要求1所述質粒pRCll的基因工程菌。
3.如權利要求2所述基因工程菌在微生物降解滷代烴汙染物中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於所述滷代烴汙染物為下列之一CH2C12、 CH2BrCl、C2H4Cl2 或 C2H2Cl2。
5.如權利要求2或3所述的應用，其特徵在於所述降解在28 32°C、pH6.8 7. 2下進行。
全文摘要
本發明提供了一種氯代脂肪烴降解性質粒pRC11，其物理圖譜見圖3，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，本發明質粒從實驗室自行建成的工業廢氣生物淨化微生物資源菌種庫中篩選獲得。本發明的有益效果主要體現在提供一種氯代脂肪烴降解性質粒——pRC11，建立了質粒的物理圖譜，該質粒遺傳背景非常清晰，可利用該質粒進行分子育種，培育高效多功能質粒菌，提高以二氯甲烷為代表的滷代烴類有機汙染物的生物降解效果，大幅度提高有機廢氣的處理能力。
文檔編號B01D53/84GK102321659SQ20111025261
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月30日 優先權日2011年8月30日
發明者吳石金, 王豔, 邱樂泉, 鍾衛鴻, 陳建孟 申請人:浙江工業大學