一種牛冷凍精液稀釋液及其製備方法
2023-05-21 11:33:46
專利名稱：一種牛冷凍精液稀釋液及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域.，涉及動物精液的超低溫冷凍保存，特別涉及 一種牛冷凍精液稀釋液及其製備方法。
背景技術：
牛精液冷凍保存與人工受精技術的結合在現代養牛業生產中發揮著極其 重要的作用，應用冷凍精液進行人工受精可以不受時間、地域、牛品種及個 體體格的限制，並且大量減少公牛的飼養數量，降低生產成本，提高優良種公牛的利用率，為養牛業帶來巨大的經濟效益。同時，牛精液冷凍技術的發展和牛冷凍精液的使用在牛品種引進、雜交改良，以及提高繁殖性能、疾病控制及牛遺傳多樣性保護方面具有重要的意義。稀釋液在冷凍精液的製作過程中是必不可少的成分，可以補充精子的營養，減少精液黏稠度，降低異物對精子的影響，同時緩和代謝產物的危害作用；另外還能夠保護精子，增強其抵抗低溫打擊和抗氧化的能力，減少冷凍所造成的損傷。目前，在冷凍精液的製作過程中，常常選擇易於抑制精子活動，減少能量消耗，延長精子壽命的弱酸性稀釋液。通常選用葡萄糖、檸檬酸鈉、卵黃、甘油、抗生素等作為稀釋液的主要成分。其中添加卵黃的目的是為了降低在向5 。C降溫過程中精子遭受冷休克的受損程度，但是，卵黃中並不是所有成分都對精子有益，其中某些成分可抑制精子呼吸，降低精子活率，如高密度脂蛋白。卵黃中對精子起保護作用的有效成分則是磷脂和低密度脂蛋白，如果在稀釋液中用低密度脂蛋白替代卵黃，則可提高冷凍一解凍 後精子質量。在我國，儘管近幾年來牛精液冷凍技術有了一定的發展，冷凍精液廣泛應用，但是目前使用的牛冷凍精液活率仍然很低， 一般在36%左右(我國牛冷 凍精液活率標準為30。％)，遠遠低於國外所使用的活率標準(50% 60%)。 由於我國牛冷凍精液活率較低，人工授精後母牛的情期配種率低，受胎率低， 從而嚴重影響了我國牛冷凍精液的進一步推廣應用及生產效率的提高。 發明內容針對目前我國牛精子冷凍後活率相對較低的缺陷，本發明的目的在於提 供一種牛冷凍精液稀釋液，應用該稀釋液冷凍牛精液解凍後活率達到50% 68%的效果，大大的提高了我國牛冷凍精液生產效率。實現上述發明目的技術方案是一種牛冷凍精液稀釋液，其特徵在於，該 100 ml稀釋液中各原料的用量為果糖0.8 1.2g、檸檬酸鈉1.4 1.6g、TRIS2.3 2.6g、低密度脂蛋白7.5 9.5 g、甘油5 8ml、青黴素8.5 12萬IU、餘量為蒸餾水。本發明的最佳配方該100ml稀釋液中各原料的用量為果糖l.Og、檸檬酸鈉L48g、 TRIS 2.42 g、低密度脂蛋白7.5 9.5 g、甘 油6.4ml、青黴素10萬IU、餘量為蒸餾水。本發明所述的低密度脂蛋白是提取於新鮮雞蛋的卵黃。本發明還有一個目的是提供製備上述牛精液冷凍稀釋液的方法，其特徵在於，包括下列步驟1)稱取各種原料果糖、檸檬酸鈉、TRIS、青黴素G鈉、甘油、低密度脂蛋白、蒸餾水備用；2) 將所述量的果糖、檸檬酸鈉、TRIS用蒸餾水配置成基礎液；3) 在步驟2)所配置的基礎液中添加所述量的青黴素G鈉和低密度脂蛋 白配製成I液；4) 在步驟3)所配置的I液中加入所述量的甘油製成II液；5) 用酸或鹼調整pH值為6 7.5，然後進行過濾滅菌，冷卻至室溫，放 入2 5 。C冰箱中備用。(本發明的製備方法生產出來的只有一種產品II.液，但是後邊使用方法中卻是先使用I液，後使用II液，這樣寫上—F文不一致)說明最終產品是II液，但首先要配置I液，前面交代清楚了，應該沒有問題。本發明在國內首次將低密度脂蛋白添加到基礎冷凍液中，進行牛精液的 冷凍保存，獲得了良好的效果，解凍後精子的存活率大大提高，顯著提高了 精液品質，該發明進一步拓展了超低溫生物學研究的範圍，為超低溫保護材 料提供了新的途徑。該方法無論在超低溫生物學領域，還是在動物繁殖生產 方面，均具有其創造性和實用性。
具體實施方式
下面結合發明人給的產品製備方法實施例、使用方法實施例來進一步說 明本發明的有益效果，但是本發明的保護範圍不僅限於此。實施例l低密度脂蛋白的提取工藝新鮮蛋黃收集後，先用等滲鹽溶液(0.17 M NaCl， w/v)將卵黃稀釋2 3 倍，並不斷攪拌lh，然後在4 。C的環境下10,000xg離心45 min後，將上清液與沉澱物分離。為避免蛋黃中所含有的小顆粒物的幹擾，同樣條件下再次 離心所分離出的上清液。將二次離心後收集的上清液與40%的硫酸銨溶液混合，在4。C的環境下充分攪拌lh後，混合物離心45min (10,000xg， 4°C)， 使溶液分層，以沉澱卵黃蛋白。離心後，棄去沉澱物，將上清液(漂浮物) 用蒸餾水透析12h，以除去溶液中的硫酸銨。在硫酸銨從溶液中完全去除後， 再次將溶液離心45min (10,000xg， 4°C)，所殘餘的漂浮即為LDL，其純度 一般可達97%。實施例2牛冷凍精液稀釋液的製備方法用電子分析天平準確稱取l.Og果糖、1.48g檸檬酸鈉、2.42gTRIS，將其 溶解於50ml蒸餾水中，用磁力攪拌器攪拌均勻後，配置成100ml基礎液。在 基礎液中添加10萬IU的青黴素G鈉和8g低密度脂蛋白配製成I液；在I液 添加6.4ml的甘油配製成II液。再用精密pH計調整pH為6. 37，然後用0. 22 ym的濾膜進行過濾，放入2 5。C冰箱中備用。I、 1I液需現用現配。.實施例3牛冷凍精液稀釋液的製備方法用電子分析天平準確稱取0.5g果糖、2g檸檬酸鈉、1.5gTRIS，將其溶解 於50ml蒸餾水中，用磁力攪拌器攪拌均勻後，配置成100ml基礎液。在基礎 液中添加5萬IU的青黴素G鈉和5g低密度脂蛋白配製成I液；在I液添加 8ml的甘油配製成n液。再用精密pH計調整pH為6.4，然後用0.22iim的濾 膜進行過濾，放入2 5匸冰箱中備用。I、 II液需現用現配。實施例4牛冷凍精液稀釋液的製備方法用電子分析天平準確稱取1.5g果糖、lg檸檬酸鈉、3g TRIS，將其溶解 於50ml蒸餾水中，用磁力攪拌器攪拌均勻後，配置成100ml基礎液。在基礎液中添加12萬IU的青黴素G鈉和10g低密度脂蛋白配製成I液；在I液添 加5ml的甘油配製成II液。再用精密pH計調整pH為6.2 6. 5，然後用0. 22 um的濾膜進行過濾，放入2 5。C冰箱中備用。I、 n液需現用現配。 試驗例以荷斯坦奶牛精液冷凍保存進行說明。(一) 冷凍稀釋液的配製用電子分析天平準確稱取l.Og果糖、1.48g檸檬酸鈉、2.42gTRIS，將其 溶解於50ml蒸餾水中，用磁力攪拌器攪拌均勻後，配置成100ml基礎液。在 基礎液中添加10萬IU的青黴素G鈉和8g的低密度脂蛋白配製成I液；在I 液添加6.4ml的甘油配製成II液。再用精密pH計調整pH為6.37，然後進行 過濾滅菌，冷卻至室溫，放入2 5。C冰箱中備用。I、 II液需現用現配。(二) 精液的採集利用假陰道採集法採集公牛精液，精液採集後，立即在37.5 。C下鏡檢， 觀察精子活力，並用分光光度計在550nm處進行比色，計算精子密度。所採 集的精液為乳白色或乳黃色，無異味，精子形態正常，密度正常，活力在0.7 以上的方可用於製作細管冷凍精液。(三) 精液冷凍1. 將用含有甘油的II液稀釋的精液快速裝管(0. 25ml細管)，封口完畢 後在5"C冰箱或恆溫箱中平衡1. 5 2h。2. 平衡完畢後，裝細管轉移至冷凍室進行冷凍。先用程序冷凍儀冷凍， 其程序是按照3。C/min降溫的速度，從5。C降溫至一6。C。3. 細管精液經過程序冷凍儀降溫至一6'C後，將細管迅速從冷凍儀中取 出，放置在離液氮液上方2 3cm處快速降溫，其降溫速率是一14(TC/ min，然後迅速投入液氮冷凍保存。(四)細管凍精的解凍及精液品質評定將超低溫冷凍的細管從液氮中迅速取出後，投入36 4(TC水域中30秒， 然後將精液與PBS液混合，在37°C的溫度下評定精液質量指標。1. 用偉力彩色精子質量檢測系統(WLJY-9000)測定精子的各種運動相 關參數。包括精子活率、活力、前向性(STR)、直線性(L工N)、曲線速度(VCL)、直線速度(VSL)、側擺幅度(ALH)、鞭打頻率(HZ)、擺動性(W0B)、 平均路徑速度(VAP)、平均移動角度(MAD)以及a、 b、 c、 d四級精子的百 分率等；2. 採用FITC標記的花生凝集素染色後用螢光顯微鏡檢測冷凍一解凍後 精子頂體的完整性。將解凍後的細管精液用37'C的PBS溶液稀釋，調整精子 密度，用移液槍吸取30叱精液塗片，自然乾燥後，室溫下用甲醇固定10min， 然後在每個精液塗片上分別滴上FITC-PNA染液，於37"C、黑暗潮溼環境下孵 育。之後用PBS液衝洗，自然乾燥後滴加增光劑，蓋上蓋玻片，再用無色指 甲油封片。用螢光顯微鏡檢查精子的頂體狀況，並用數位相機拍照。3. 利用低滲膨脹試驗(HOST)檢查精子質膜的完整性。用移液槍吸取 精液樣品與低滲溶液混合，在37 。C下孵育30 min後，取15 pL精液樣品於 血細胞計數板上，400X倒置顯微鏡下觀察不同部位的5個視野，根據精子是 否呈現巻尾來判斷質膜的完整性。(六)評定結果應用本發明的冷凍稀釋液以及精液的冷凍一解凍方法，其評定結果如下: 1.冷凍一解凍後精子活率達50 68%以上；2. 冷凍一解凍後精子直線運動速度達30 35txm/s;精子直線性達55% 以上；精子平均路徑速度達35 38um/s; a級精子的百分率達到35%以上；3. 精子的頂體完整率達72%以上；4. 精子的質膜完整率達55%以上。
權利要求
1.一種牛冷凍精液稀釋液，其特徵在於，該100ml稀釋液中各原料的含量為果糖0.8～1.2g、檸檬酸鈉1.4～1.6g、TRIS2.3～2.6g、低密度脂蛋白7.5～9.5g、甘油5～8ml、青黴素8.5～12萬IU、餘量為蒸餾水。
2. 根據權利要求l的所述牛冷凍精液稀釋液，該100ml稀釋液中各原 料的含量為果糖1 .Og、檸檬酸鈉1.48g、 TRIS 2.42 g、低密度脂蛋白8.0 g、甘油6.4ml、青黴素10萬IU、餘量為蒸餾水。
3. 根據權利要求1的所述牛冷凍精液稀釋液，其特徵在於，所述的低 密度脂蛋白是提取於新鮮雞蛋的卵黃。
4. 製備權利要求1所述的牛精液冷凍稀釋液的方法，其特徵在於，包 括下列步驟1) 稱取各種原料果糖、檸檬酸鈉、TRIS、青黴素G鈉、甘油、低密度 脂蛋白、蒸餾水備用；2) 將所述重量的果糖、檸檬酸鈉、TRIS用蒸餾水配置成基礎液；3) 在步驟2)所配置的基礎液中添加所述量的青黴素G鈉和低密度脂 蛋白配製成I液；4) 在步驟3)所配置的I液中加入所述量的甘油製成II液；5) 用酸或鹼調整pH值為6 7.5，然後進行過濾滅菌,冷卻至室^a，放入2 5 x:冰箱中備用。
全文摘要
本發明公開了一種牛冷凍精液稀釋液，該100ml稀釋液中各原料的用量為果糖0.8～1.2g、檸檬酸鈉1.4～1.6g、TRIS 2.3～2.6g、低密度脂蛋白7.5～9.5g、甘油5～8ml、青黴素8.5～12萬IU、餘量為蒸餾水。其製備方法是將果糖、檸檬酸鈉和TRIS溶於蒸餾水中配製成基礎液；在基礎液中加入青黴素G鈉和低密度脂蛋白配製成I液；在I液中添加甘油即配製成II液；再調pH值為6～7.5，然後進行過濾滅菌，冷卻至室溫，放入2～5℃冰箱中備用。本發明的牛冷凍精液稀釋液效果良好且可靠，能夠為牛人工受精提供高質量的優質細管冷凍精液，具有十分廣闊的市場應用前景。
文檔編號C12N5/06GK101220345SQ20081001738
公開日2008年7月16日 申請日期2008年1月23日 優先權日2008年1月23日
發明者李青旺, 江中良, 胡建宏, 趙宏偉 申請人:西北農林科技大學