重組人血白蛋白的液體製劑的製作方法
2023-05-19 01:16:21 2
本發明公開了一種重組人血白蛋白的液體製劑，屬於生物製劑技術領域。
背景技術：
人血白蛋白（hsa）是存在於人循環系統中的最普遍的血液蛋白，由585個胺基酸組成，分子量為66kd。它在人體內承擔著相當大的作用，如具有維持血液滲透壓和攜帶血液中多種配基（包括胺基酸，脂肪酸，金屬離子，類固醇及藥物）與組織進行交換等生理功能。
在臨床上，人血白蛋白被用於低蛋白血症、胎兒紅細胞增多症、各種原因引起的出血性休克及肝硬化腹水等的治療。另外人血白蛋白還被用作藥物賦形劑、穩定劑以及細胞培養添加劑。在過去的幾十年間，由於人血白蛋白的廣泛應用，其需求量變得非常巨大，總需求量超過500噸/年。
儘管已經在提取工藝上取得了巨大的進步，但傳統血漿來源的人血白蛋白還是遠遠不能滿足現在的市場需求。而且由於血液中存在各種傳染性疾病病原體的潛在危險，尤其是愛滋病、B肝等病毒的傳播，來自人源血漿的白蛋白在純化過程中難免將這些病毒帶入終產品。基於上述原因，利用基因重組技術生產的重組人血白蛋白（rhsa）既可避免病原體感染；同時可以解決血液供應有限的難題。
重組蛋白藥物產品本身是一個複雜的大分子結構，經過蛋白質複雜的翻譯後加工與修飾，形成具有高度特異性的三、四維結構，如重組人血白蛋白就是由585個胺基酸摺疊成三螺旋結構域的多肽鏈，分子中含有35個半胱氨酸和17個二硫鍵。rhsa與其他任何蛋白質一樣，其生物學活性如其結合親和性或者中和活性依賴至少核心胺基酸序列的構象完整性，同時需要保護蛋白質的多個功能集團保持穩定。
化學和物理不穩定性均可導致蛋白質變性。因為蛋白質藥物比傳統的有機和無機藥物更大且更複雜，因此這種重組蛋白藥物的製劑會出現特殊問題。蛋白質的穩定性可以受到多種因素影響，包括離子強度、ph、溫度、重複冷凍/解凍循環、蛋白質濃度和剪切力。蛋白質的活性可以由於物理不穩定性和化學不穩定性而喪失，物理不穩定性包括變性、聚集(可溶及不可溶聚集體形成)、沉澱與吸附；化學不穩定性包括外消旋化、β-消除或者二硫鍵交換、水解、脫醯胺作用和氧化等等。這些不穩定性均可能導致生物學活性的降低、毒性和/或免疫原性的增加，蛋白質副產物或者衍生物的形成。因此，提供一種能穩定保存重組人血白蛋白，並適合於實際臨床使用的製劑處方是很有意義的。
雖然現有技術領域指出了可適用於生產特定蛋白質製劑的許多製劑輔料，但是不能預測為了克服特定蛋白質可能具有的特定的不穩定性問題而應該加入哪些輔料以及應該加入的量。因此找尋用於配製rhsa製劑的合適輔料和最佳條件充滿了挑戰。
技術實現要素：
為了解決上述問題，本發明的申請人進行了大量的實驗，對可以用於rhsa製劑的輔料的類型和用量進行了大量的篩選，公開的rhsa液體製劑能夠充分防止重組人血白蛋白的聚集、降解、氧化和變性等，具有使重組人血白蛋白長時間保持穩定，保持其生物學活性，方便於臨床使用，從而達到了本發明的目的。
為達到上述發明目的，本發明採用的技術方案為：
一種重組人血白蛋白的液體製劑，所述液體製劑主要成分為：重組人血白蛋白、等滲調節劑、蛋白保護劑和蛋白熱穩定劑，ph6.4~7.4。
所述的重組人血白蛋白濃度為100~250g/l。
所述的等滲調節劑為氯化鈉，濃度為100~150mmol/l。
所述的蛋白保護劑為吐溫80或吐溫20，濃度為10~50mg/l。
所述的蛋白熱穩定劑為辛酸鈉，濃度為0.14~0.18mmol/l。
所述的重組人血白蛋白的液體製劑優選為，由100～250g/l重組人血白蛋白、115mmol/l氯化鈉、15mg/l吐溫80、0.16mmol/l辛酸鈉組成，ph值為7.0。
本發明公開的製劑可以使重組人血白蛋白在2～8℃條件下至少2年保持穩定。
本發明公開的液體製劑的製備方法，包括以下步驟：
⑴配置氯化鈉濃度為100~150mmol/l的水溶液；
⑵純化得到的重組人血白蛋白用超濾膜濃縮，用步驟⑴配置的水溶液進行換液；
⑶換液完成，重組人血白蛋白溶液中加入吐溫80或吐溫20中的一種，終濃度為10~50mg/l；加入辛酸鈉，終濃度為0.14~0.18mmol/l；
⑷重組人血白蛋白溶液以稀酸或稀鹼調ph至6.4~7.4。
上述製備方法中，步驟⑴中優選超濾膜截留分子量為10000~30000。
本發明公開的液體製劑，在治療低蛋白血症的藥物中的應用。
本發明公開的液體製劑，在動物細胞培養基製備中的應用。
在臨床上，已有很多關於聚合形式的蛋白質在臨床使用過程中產生過敏性反應的報導。因此重組蛋白藥物產品的均一性被認為是與安全問題緊密相關的。人血白蛋白臨床應用上也發生過由於人血白蛋白聚合物引起的過敏反應，因此要求對重組人血白蛋白產品中的聚合體含量進行嚴格的限制，為了保證其安全性，藥典規定一般情況下多聚體總量應少於5%，二聚體的含量小於2%。
對於聚合體的控制，除了在工藝過程中進行嚴格的控制外，蛋白藥物本身的製劑對聚合體的產生也具有重要影響。本發明提供的重組人血白蛋白的液體製劑可以使重組人血白蛋白在2～8℃條件下至少2年保持穩定，尤其能夠防止重組人血白蛋白的聚集而產生的質量問題；且能夠充分防止重組人血白蛋白的降解、氧化和變性等，使重組人血白蛋白長時間保持穩定，保持其生物學活性；且液體劑型使用方便，適用於臨床使用。
具體實施方式
以下結合實施例進一步說明本發明，重組人血白蛋白按照專利號為zl200510068187.x的中國專利《一種純化重組人血白蛋白的方法》公開的方法製備。除特別說明，其他輔料均為市售藥用輔料級別。
本發明中，多聚體檢測方法參照2010年版《中國藥典》三部附錄d「分子排阻色譜法」進行。純度檢測參照2010年版《中國藥典》三部附錄c「sds-聚丙烯醯氨凝膠電泳法」進行。可見異物檢測按照2010版《中國藥典》三部附錄b「可見異物檢查法」進行。
實施例一重組人血白蛋白液體製劑的製備
根據需要，配置氯化鈉濃度為100~150mmol/l的水溶液；純化得到的重組人血白蛋白用超濾膜濃縮，用上述配置的氯化鈉水溶液進行換液；換液完成，重組人血白蛋白溶液中加入吐溫80或吐溫20中的一種，終濃度為10~50mg/l；加入辛酸鈉，終濃度為0.14~0.18mmol/l；最後以稀酸或稀鹼調ph至6.4~7.4，獲得半成品產品。所用水為注射用純水。
最終製備所得8組重組白蛋白溶液製劑的配比組成詳見表1.
註：上表中標示4號、8號樣品製劑配方中辛酸鈉、乙醯色氨酸配製參照2010版藥典三部中人血白蛋白製劑組成。
將半成品產品無菌分裝至西林瓶中，加蓋膠塞及鋁塑蓋，獲得成品。
實施例二製備液體製劑純度檢測
按表2的保存條件將實施例1中製備的編號為1～8的8組樣品進行保存，定期採用sds-page非還原電泳法進行純度測定。分離膠濃度12.5%，加樣量不低於10μg，考馬斯亮藍r-250染色，經掃描儀掃描，分析結果如下。
試驗結果表明，上述1~8號樣品中本發明提供的製劑在2-8℃保存3年，或25℃保存6個月，或37℃保存1周的情況下純度仍能保持在99.0%以上。1、2、3、5、6、7號樣品可以在37℃保存3周的情況下純度仍能保持在99.0%以上。
實施例三製備液體製劑聚體含量檢測
實施例二的保存樣品，定期用分子篩高壓液相層析（sec-hplc，tskg3000swxl7.8mmx30cm）檢測液體製劑中重組人血白蛋白聚體的含量。
聚體檢測方法參照2010年版《中國藥典》三部附錄d「分子排阻色譜法」，所用儀器：watershplc系統（光電二極體陣列檢測器）；色譜柱：tskg3000swxl7.8mmi.d.x30cm；流動相：200mmol/lpb，1%異丙醇，ph7.0；流速：0.5ml/min；上樣量：100µg；檢測波長：280nm。
試驗結果表明，本發明提供的重組白蛋白的液體製劑在2-8℃保存3年，或25℃保存6個月，37℃保存3周的情況下sec-hplc單體純度仍能保持在95%以上。且可明顯看出上述3種保存條件下，1、2、3、5、6、7號樣品隨時間增加產生的聚體含量明顯低於同時間點保存的4、8號樣品。由此可見，本發明提供的重組白蛋白液體製劑可在重組人血白蛋白濃度範圍100~250g/l時，防止蛋白聚集產生聚體。
實施例四製備液體製劑可見異物檢測
實施例二的保存樣品，定期取出進行可見異物檢測，檢測方法如下：
取供試品，除去容器標籤，擦淨外壁汙痕，放室溫靜置過夜。
在避光室內或暗處，手持供試品容器瓶頸部於遮光板邊緣處，輕輕旋轉和翻轉容器，使藥液中可能存在的可見異物懸浮（注意不使藥液產生氣泡）。
在明視距離（指供試品至人眼的清晰觀察距離，通常為25cm），分別在黑色和白色背景下，用目檢視，檢查時限為20秒。
檢查時被觀察樣品放置處的光照度應為2000～3000lx。
本實施例中可見異物結果計算方法為所保存10瓶樣品的可見異物的加和總數。
試驗結果表明，上述樣品1~8號中本發明提供的製劑在2-8℃保存1年，或25℃保存6個月，37℃保存3周的情況下1、2、3、5、6、7號樣品隨時間增加並未檢出可見異物；4、8號樣品在各個保存條件下均有可見異物檢出，且隨著蛋白濃度和溫度的升高，可見異物明顯增加。
由此可見，本發明提供的重組白蛋白液體製劑可在重組人血白蛋白濃度範圍100~250g/l時，可有效防止蛋白微絲、顆粒及絮狀沉澱的產生。
實施例五製備液體製劑熱穩定性檢查
取供試品置57±0.5℃水浴中保溫50小時後，用上述實施例四中檢查裝置，與同批未保溫的供試品比較，觀察顏色變化。
試驗結果表明，只有4、8號樣品顏色略有變化，其他樣品經57±0.5℃水浴中保溫50小時後無變化，由此可見，本發明提供的重組人血白蛋白液體製劑可在重組人血白蛋白濃度範圍100~250g/l時，可保護重組人血白蛋白的熱穩定性。