皮下轉移的臟器癌螢光原位移植模型建立的方法

2023-05-18 19:56:41

專利名稱：皮下轉移的臟器癌螢光原位移植模型建立的方法
技術領域：
本發明涉及一種內臟臟器(如結腸等臟器)癌變的研究方法，尤其是結腸癌變原 位移植模型建立的方法。
二背景技術：
中國專利CN200710019273.0是本申請發明的一種結直腸癌造口原位移植模型的 建立方法，包括以下步驟a)細胞株選擇或進行細胞培養，採用結腸腺癌細胞株 細胞濃度製成(1±0.5) 乂106的細胞懸液；b)對動物活體結腸造口，步驟是，將其 盲腸提出腹壁，視實驗動物不同長度為0.3-2cm並與周圍皮膚固定、癒合；d)造口 處腫瘤原位移植，步驟是，取小鼠結腸腺癌細胞混懸液0.1-lml接種在造口黏膜下， 自然生長。但對動物活體結腸造口原位移植模型的建立在研究觀察過程中仍有不足之 處。
結腸癌原位移植模型的建立對於結腸癌的治療研究有重要的意義，但是由於結腸 癌位置較深，難以觀察腫瘤的大小，更無法觀察腫瘤轉移和復發的情況，在研究中的 應用受到一定的限制。螢光蛋白在激發的情況下可以發生螢光，如果移植的腫瘤中攜 帶螢光，這樣就可以直接觀察到腫瘤的生長、轉移的情況。但是如果腫瘤生長在腹腔 中，即使有螢光腫瘤觀察也不十分容易。
三
發明內容
本發明目的是提出一種皮下轉移的臟器癌螢光原位移植模型建立的方法，尤其 是結腸、胰腺等內臟臟器癌螢光原位移植模型建立的方法。
本發明的技術方案是將移植了腫瘤的盲腸轉移至皮下，本發明方法使腫瘤生長實驗條 件更接近於生長在臟器內，而且螢光觀察更為容易，是臟器癌研究方法的重要改進。 本發明的技術方案是皮下轉移的臟器癌螢光原位移植模型建立的方法，其特徵 是選用人結腸腺癌細胞株或相應臟器的癌細胞株，綠色螢光蛋白(GFP)質粒通過 逆轉錄病毒pLPCX對臟器的癌細胞株進行轉染使臟器的癌細胞株含有GFP的表達
質粒，選擇表達GFP的包裝細胞，然後細胞株中加入病毒並培養在含有800 ug/叩l of G418的選擇液中。.GFP基因通過T4連接酶與pLPCX載體連接，GFP-pLPCX載體 被轉染至PT67包裝細胞，得到轉染的癌細胞株.選用裸鼠並在其皮下接種Lcwo細胞 懸液注入皮下0.2mL/只，注射完畢後，對注射部位進行觀察，約4周成瘤，腫瘤生長 至5mm，觀察到綠色螢光後開始進行原位移植；結腸皮下轉移的結腸癌螢光原位移 植模型建立裸鼠腹腔注射麻醉，左腹部碘酊消毒，將皮膚及腹膜剪一小口，將裸 鼠肓腸提出腹膜外約lcm，縫合盲腸與腹膜間隙，將盲腸轉移至皮下；讓切開盲腸漿 膜，縫線2塊直徑約為lmm的攜帶螢光的腫瘤移植在盲腸處，關閉皮膚。
同樣，在胰腺癌模型胃癌建立時，尋找相應的臟器,將臟器的部分轉移在皮下,縫合
3腹膜後,在轉移在皮下的部分移植帶螢光的組織塊，縫合腹部.
四

圖l:將腫瘤移植在就盲腸處，然後將盲腸移植至皮下的裸鼠照片 圖2:皮下腫瘤在螢光燈下顯示綠色螢光，可觀察腫瘤大小
五具體實施方式
材料與方法
1、試驗動物BALB/C nu/nu裸鼠，SPF級，購自北京科麗華實驗動物中心，體 重24 28g，分籠飼養於獨立送風籠具，室溫控制在24°C 25°C ，相對溼度50% 60%。
2、 細胞株及細胞培養選擇相應腫瘤得細胞株,以RPMI-1640培養基，10%小 牛血清，在37。C， 5XC02培養，0.25。/。胰酶-EDTA消化，PBS洗2次，調整細胞濃 度製成1乂106的細胞懸液。
3、 綠色螢光蛋白(GFP) pLPCX逆轉錄病毒質粒的構建和腫瘤細胞的轉染含 有GFP的表達質粒pEGFP-N3 (-)購自BD Biosciences Clontech (BD Biossciences, CA USA)，逆轉錄病毒pLPCX購自Clontech Laboratories, Inc. (Takara, J叩an).使用含有限 制性內切酶BglII和ClaI位點的引物擴增GFP片段，PCR產物在純化後與pLPCX 逆轉錄病毒載體使用限制性內切酶Bgl II和Cla I消化，(Takara, Dalian, China).GFP 基因通過T4連接酶(Takara, Dalian, China).與pLPCX載體連接，GFP-pLPCX載體被 轉染至PT67包裝細胞(Takara， Japan),使用G418 (Gibico, USA)選擇表達GFP的包裝 細胞。腫瘤細胞在轉染前24小時裂解，轉染前細胞濃度為20-40%。包裝細胞培養在 含有10X小牛血清的RPMI1640培養液中，當濃度達到70_80%時候，使用0.4544n 細胞篩進行過濾，然後向HT-29細胞中加入病毒並培養在含有800 ug/ml ofG418的選 擇液中。.
4、裸鼠皮下接種模型的建立裸鼠頸部右側皮膚消毒，用一次性lmL注射器 將腫瘤細胞懸液注入皮下0.2mL/只。注射完畢後，對注射部位進行觀察，約4周成瘤， 腫瘤生長至5mm,可以觀察到綠色螢光後開始進行原位移植。
5、結腸皮下轉移的結腸癌螢光原位移植模型建立氯胺酮(0.17mg/)裸鼠腹腔 注射麻醉，左腹部碘酊消毒，將皮膚及腹膜剪一小口，將裸鼠需要建立模型的臟器 部分提出腹膜外約lcm，縫合臟器與腹膜間隙，將臟器轉移至皮下；讓切開漿膜，以 8 — 0縫線2塊直徑約為lmm的攜帶螢光的腫瘤移植在臟器處(這句能否再解釋一下)， 關閉皮膚。
結論10隻移植的結腸癌和5隻胰腺癌的裸鼠均生存，腫瘤移植後3-5天即可看 到移植的腫瘤發出螢光，2周後腫瘤生長至5mm， 8周後腫瘤生長至20mm，處死動 物，發現有繫膜淋巴結轉移。當然，採用肝癌和胃癌的裸鼠也是比較適合的，採用本 發明的方法，能夠有效的促進腫瘤生物科技的研究。
權利要求
1、皮下轉移的臟器癌螢光原位移植模型建立的方法，其特徵是選用人結腸腺癌細胞株或相應臟器的癌細胞株綠色螢光蛋白，綠色螢光蛋白GFP質粒通過逆轉錄病毒pLPCX對臟器的癌細胞株進行轉染使臟器的癌細胞株含有GFP的表達質粒，.GFP基因通過T4連接酶與pLPCX載體連接，GFP-pLPCX載體被轉染至PT67包裝細胞，得到Lovo細胞；選用裸鼠並在其皮下接種Lovo細胞懸液注入皮下，注射完畢後，對注射部位進行觀察，約4周成瘤，腫瘤生長至5mm，觀察到綠色螢光後開始進行原位移植；裸鼠腹腔注射麻醉，左腹部碘酊消毒，將皮肽及腹膜剪一小口，將裸鼠肓腸提出腹膜外約1cm，縫合盲腸與腹膜間隙，將盲腸轉移至皮下；讓切開盲腸漿膜，縫線2塊直徑約為1mm的攜帶螢光的腫瘤移植在盲腸處，關閉皮膚。
2、 根據權利要求1所述的皮下轉移的臟器癌螢光原位移植模型建立的方法，其 特徵是腫瘤細胞以RPMI-1640培養基，10%小牛血清，在37。C， 5XC02培養，0.25% 胰酶-EDTA消化，PBS洗2次，調整細胞濃度製成1 X 106的細胞懸液。
3、 、根據權利要求1所述的皮下轉移的臟器癌螢光原位移植模型建立的方法，其 特徵是逆轉錄病毒pLPCX.使用含有限制性內切酶Bgl II和Cla I位點的引物擴增 GFP片段，PCR產物在純化後與pLPCX逆轉錄病毒載體使用限制性內切酶BglII和 Clal消化，GFP基因通過T4連接酶與pLPCX載體連接，GFP-pLPCX載體被轉染 至PT67包裝細胞，使用G418選擇表達GFP的包裝細胞；HT_29細胞在轉染前24 小時裂解，轉染前細胞濃度為20-40%。包裝細胞培養在含有10%小牛血清的 RPMI1640培養液中，當濃度達到70 — 80%時候，使用0.45+m細胞篩進行過濾，然 後向HT-29細胞中加入病毒並培養在含有800ug/mlofG418的選擇液中。.
4.根據權利要求1所述的皮下轉移的臟器癌螢光原位移植模型建立的方法， 其特徵是裸鼠皮下接種模型的建立時，對裸鼠頸部右側皮膚消毒，用一次性lmL注 射器將Lovo細胞懸液注入皮下0.2mL/只。
全文摘要
皮下轉移的臟器癌螢光原位移植模型建立的方法，選用人結腸腺癌細胞株或相應臟器的癌細胞株綠色螢光蛋白，綠色螢光蛋白GFP質粒通過逆轉錄病毒pLPCX對臟器的癌細胞株進行轉染使臟器的癌細胞株含有GFP的表達質粒，.GFP基因通過T4連接酶與pLPCX載體連接，GFP-pLPCX載體被轉染至PT67包裝細胞，得到Lovo細胞；選用裸鼠並在其皮下接種Lovo細胞懸液，約4周成瘤，觀察到綠色螢光後開始進行原位移植；將皮膚及腹膜剪一小口，將裸鼠肓腸提出腹膜外約1cm，縫合盲腸與腹膜間隙，將盲腸轉移至皮下；讓切開盲腸漿膜，縫線2塊直徑約為1mm的攜帶螢光的腫瘤移植在盲腸處，關閉皮膚。
文檔編號G01N21/64GK101502444SQ20081024261
公開日2009年8月12日 申請日期2008年12月29日 優先權日2008年12月29日
發明者楊志堅, 金黑鷹 申請人:南京源端生物科技有限公司