一種用於檢測膀胱癌RT‑qPCR試劑盒及檢測方法與流程
2023-05-19 06:31:51 1
本發明涉及癌症診斷檢測用的試劑盒領域，具體為一種用於檢測膀胱癌的rt-qpcr試劑盒及檢測方法。
背景技術：
膀胱癌是人體最常見的惡性腫瘤之一，其惡性度高，侵襲性強，易復發和遠處轉移，給臨床治療帶來很大困難。但早期發現和治療，5年的存活率大於90％，因此早期診斷是提高膀胱癌治療效果和患者遠期生存的關鍵。
目前膀胱癌的診斷和術後隨訪主要依靠尿脫落細胞檢查和膀胱鏡檢查。但尿脫落細胞檢查的敏感性低，尤其是低級別的腫瘤，因此膀胱癌的診斷仍依賴膀胱鏡檢加活檢，膀胱癌術後隨訪也主要依賴膀胱鏡檢查。膀胱鏡檢查敏感性和準確度雖然都很高，但是具有創傷性，給病人帶來不少痛苦。
腫瘤標誌物檢測技術被認為是早期發現無症狀微灶腫瘤的唯一途徑，腫瘤標誌物試劑盒在膀胱癌早期診斷及篩查中起到至關重要的作用。
因此，尋找膀胱癌腫瘤標誌物來早期發現或診斷膀胱癌是當前膀胱癌研究中的熱點。最新研究表明，尿上清中存在大量dna或rna標記物，因此檢測尿液中dna或rna標記物有望為膀胱癌的診斷提供一個新方法。
雖然已經有30多種尿液標記物可用於膀胱癌的診斷，但是用於診斷膀胱癌試劑盒只有：urovyv50(fish方法)，nmp-22(elisa方法)，bta(elisa)，immunocyt(elisa)；而且這些方法都或多或少存在敏感性不高，假陽性率和假陰性率過高的問題，無法取代膀胱鏡檢查。目前國際市場用於膀胱癌診斷且敏感性較高的僅有cxbladder(rna診斷)試劑盒，該試劑盒檢測尿脫落細胞中rna標記物：cdc2，hoxa13，mdk，igfbp5和cxcr5其敏感性達到83％，特異性達到85％，可以作為膀胱鏡檢查的補充。
總的來說，現有膀胱癌診斷試劑盒的靈敏性及準確性都偏低，臨床意義有限，滿足不了早期診斷的要求。為了提高膀胱癌的早期診斷，提高術後生存率，改善病人生存質量，有必要開發新的腫瘤標誌物並進行產業化，製備一種靈敏度高、準確性強、使用方便、價格便宜且高效的膀胱癌診斷及術後監護的診斷試劑盒。
技術實現要素：
本發明針對現有技術的不足之處，提供一種敏感性及特異性優良的用於檢測膀胱癌的rt-qpcr試劑盒。
本發明另一目的是提供一種用於檢測膀胱癌的rt-qpcr檢測方法。
為解決上述的技術問題，本發明採用如下技術方案：一種用於檢測膀胱癌的rt-qpcr試劑盒，包括檢測survivin基因的引物：
survivin正向引物：atgggtgccccgacgttgc；
survivin反向引物：ccctccaagaagggccagtc；
survivin特異性探針：ccctttctcaaggaccacc-。
一種用於檢測膀胱癌的rt-qpcr檢測方法,其包括的步驟如下：
(1)取30ml尿液離心(其中轉速2000rpm，時間10分鐘，溫度4℃)，收集上清液放入另一試管；
(2)取5ml上清液加入1mlexoquick的exosome提取液，在4℃孵化12小時，混合液離心後(轉速為1500g，時間為30分鐘)使得exosome沉澱在試管底，去除上液後用100ul不含rnaase(核糖核酸酶)水懸浮exosome；
(3)在exosome試管中加入700ulqiazol洗脫液，震蕩後加入120ulchloroform(三氯甲烷)；離心(轉速14000rpm，時間15分鐘，溫度4℃)後取上清，加入同體積的體積比濃度為100％酒精；把混合液放入rna純化柱，離心後加700ul洗滌液，離心後再用500ul洗滌液洗一次，最後加入15ul不含rnaase水，離心收集rna的液體，取2ul測rna的質量與數量；
(4)用一步法rt-qpcr測定survivin
正向引物：atgggtgccccgacgttgc
反向引物：ccctccaagaagggccagtc
tagman探針：ccctttctcaaggaccacc-
pcr混合物使用為：25ul的2xmix，1ul的正向引物(10um)，1ul的反向引物(10um)，1ultagman探針(10um)，1ul的taq酶；
pcr反應的條件為：95℃，15分鐘，95℃，2分鐘後進行40個循環，95℃，15秒，60℃30秒。
與現有技術相比，本發明的具有如下有益效果：
(1)本發明可以同時檢測survivin在尿脫落細胞和尿液離心後上清液中exosomerna的表達，靈敏性和準確性都將近90％，大大提高膀胱癌的早期診斷率，有效減輕患者痛苦，節約患者治療開支，降低膀胱癌死亡率。
(2)本發明既可用於膀胱癌的診斷和鑑別診斷，又可用於膀胱癌治療後的複查和高危人群的篩查，具有廣闊的應用前景。
(3)本發明是對現有腫瘤診斷試劑行業有力的補充，且將腫瘤診斷試劑水平提升到一個新高度，對行業的發展及技術進步產生深遠影響。
具體實施例
為了更好地闡述本發明內容，下面用若干較佳的具體實施例進行說明。但這些具體實施例只是為了說明本發明的內容，而不是對本發明內容進行限制。原理說明
exosomes(中文名外泌體，因其形態而得名)，是細胞外泌囊泡中體積較小的一種，是一種能被大多數細胞分泌的微小膜泡，具有脂質雙層膜結構，直徑大約40-100nm。外泌體於1983年即被發現，但一直被認為是一種細胞廢棄物。最近發現這種微小膜泡中含有細胞特異的蛋白、脂質和核酸，能作為信號分子傳遞給其它細胞從而影響其它細胞的功能。這些發現點燃了人們對細胞分泌膜泡的興趣。最近的研究發現外泌體在很多生理病理上起著重要的作用，如免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復等。不同細胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標誌物。
而尿上清中有大量從癌細胞分泌出來的exosomes，這些exosomes含有大量rna或dna標記物。
本發明從眾多的標記物中篩選出與cxbladder的標記物完全不同的survivin。survivin在膀胱癌中有較高表達。可大大提高診斷的敏感性和特異性。，本發明可同時檢測和survivin在尿細胞和上清中exosomerna的表達，開闢了一種全新的膀胱癌診斷與術後隨訪監測的方法。
survivin(生存素)基因是一種重要的凋亡抑制基因，具有獨特的分子結構及生物學功能。在細胞凋亡、細胞周期的調節和血管形成中有著關鍵作用。而且survivin作為凋亡抑制蛋白家族的成員，在正常組織中無表達，但在多種腫瘤組織中高表達，且與腫瘤進展和術後判斷有關，在膀胱癌中有較多研究。survivin在膀胱癌ⅰ、ⅱ、ⅲ級表達分別為55％、75％、81％。說明惡性程度越高survivin表達越豐富。即survivin在膀胱癌中有高表達，可以大大提高診斷的敏感性和特異性。
一種用於檢測膀胱癌的rt-qpcr試劑盒，包括檢測survivin基因的引物：
survivin正向引物：atgggtgccccgacgttgc；
survivin反向引物：ccctccaagaagggccagtc；
survivin特異性探針：ccctttctcaaggaccacc-。
一種用於檢測膀胱癌的rt-qpcr檢測方法,其包括的步驟如下：
(1)取30ml尿液離心(其中轉速2000rpm，時間10分鐘，溫度4℃)，收集上清液放入另一試管；
(2)取5ml上清液加入1mlexoquick的exosome提取液，在4℃孵化12小時，混合液離心後(轉速為1500g，時間為30分鐘)使得exosome沉澱在試管底，去除上液後用100ul不含rnaase(核糖核酸酶)水懸浮exosome。
(3)在exosome試管中加入700ulqiazol洗脫液，震蕩後加入120ulchloroform(三氯甲烷)；離心(轉速14000rpm，時間15分鐘，溫度4℃)後取上清，加入同體積的體積比濃度為100％酒精；把混合液放入rna純化柱，離心後加700ul洗滌液，離心後再用500ul洗滌液洗一次，最後加入15ul不含rnaase水，離心收集rna的液體，取2ul測rna的質量與數量；所述洗滌液可以選用體積比為70％乙醇溶液。
(4)用一步法rt-qpcr測定survivin
正向引物：atgggtgccccgacgttgc
反向引物：ccctccaagaagggccagtc
tagman探針：ccctttctcaaggaccacc-
pcr混合物使用為：25ul的2xmix，1ul的正向引物(10um)，1ul的反向引物(10um)，1ultagman探針(10um)，1ul的taq酶；
pcr反應的條件為：95℃，15分鐘，95℃，2分鐘後進行40個循環，95℃，15秒，60℃30秒。
用ct值確定反應的陰陽性。
通過臨床驗證，結果見下表：
結果表明，survivin對膀胱癌的敏感性和特異性分別為88.2％和82.6％；
上表在對50多例膀胱癌的尿脫落細胞的rt-qpcrsurvivin的檢測顯示，其敏感性及特異性均將近90％。同時對尿脫落細胞和尿液離心後上清的exosome進行檢測可提高敏感性，因尿液中含有大量的腫瘤exosomes，尿exosomerna應為膀胱癌病人液體活檢(liquidbiopsy)最佳途徑。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。