一種用於臨床檢測的測序方法
2023-05-19 15:02:31 2
專利名稱：一種用於臨床檢測的測序方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，尤其涉及一種結合螢光定量PCR的基因測序方法。
背景技術：
測序技術是生物技術領域具有劃時代意義的發明，該技術在基因擴增(聚合酶鏈反應，PCR)的基礎上，直觀的得到目的片段的核酸序列，為突變發現、疾病分析等提供了可能。測序技術是公認的序列分析和突變位點檢測的「金標準」，使用測序技術，不但能檢測已知的突變位點，亦能發現未知的突變位點。同時，測序技術也是病原微生物分型的理論基礎，B型肝炎病毒、C型肝炎病毒等病原微生物的亞型分型原理就是基於病毒的全基因組序列差異或部分基因區域的序列差異。近年來，臨床診斷領域常遇到的耐藥位點突變、病毒亞型分型等新問題，需要新的技術和產品予以解決。而傳統的測序技術使用定性PCR結合電泳檢測模式對目的核酸片段進行擴增和擴增後的效果檢測，存在一些弊端，不適用於臨床診斷領域。這些弊端包括
(1)反應時間長，定性PCR結合電泳檢測，一般需要2 3個小時的時間；
(2)在電泳時，需要打開PCR反應管，在PCR產物純化過程中，需要切膠，這些操作時間長，容易產生大量的PCR產物氣溶膠，引起假陽性；
(3)電泳檢測的靈敏度低，造成低濃度模板漏檢；
(4)切膠過程中將損失大量PCR產物，影響低濃度模板的測序效果；
(5)PCR產物的產量只能通過電泳圖譜粗略估計，而在測序反應中，過多的PCR產物將使測序引物過快消耗，造成測序峰圖不正常。螢光定量PCR技術是完全閉管操作(整個過程中，僅有加入樣品一次開蓋)，直接探測PCR過程中螢光信號的變化以獲得定量的結果，不需要PCR後電泳處理，一舉克服了定性 PCR技術的諸多難題，為PCR的臨床應用又開闢了新的道路。但是螢光定量PCR是將檢測的目的片段和探針設計在目的物的DNA或RNA的保守區域，單一的螢光定量PCR技術只能檢測目的核酸的載量而無法檢測目的物的類型和是否具有相關突變。
發明內容
本發明要解決的技術問題有兩個方面，一個是克服現有技術的弊端，提供一種適用於臨床診斷領域的基因測序方法，另一個方面是，提供基於該方法在製備基因檢測試劑盒中的應用。為此，本發明通過下述技術方案予以實現。在本發明第一個方面，提供了一種結合螢光定量PCR的基因測序方法，它包括如下步驟
(1)螢光定量PCR使用目的片段特異性的引物和螢光探針，對目的片段的核酸模板， 進行擴增，得到目的片段的定量結果和PCR產物；
(2)酶解用外切酶(ExoI)和牛小腸鹼性磷酸酶(CIAP)處理步驟(1)得到的PCR產物，以降解多餘的引物和dNTP，避免對後續反應的幹擾；
(3)測序反應使用目的片段特異性的測序引物，對步驟(2)得到的酶解產物進行延伸反應，獲得帶螢光標記的測序產物；
(4)測序產物純化使用醋酸鈉、無水乙醇、甲醯胺處理步驟(3)得到的測序產物，以獲得高純的測序產物；
(5)測序儀檢測將步驟(4)得到的測序產物在測序儀上進行檢測，獲得目的片段的基因序列。在本發明的另一個方面，提供了基於上述方法在製備基因檢測試劑盒中的應用， 所述基因檢測試劑盒至少包含
(1)用於螢光定量PCR的各反應試劑，至少包括PCR反應液、目的片段特異性的上遊 PCR引物、目的片段特異性的下遊PCR引物、目的片段特異性的螢光探針、耐高溫的DNA聚合酶；
(2)用於PCR產物酶解的試劑，至少包括外切酶和牛小腸鹼性磷酸酶；
(3)用於測序反應的試劑至少包括目的片段特異性的測序引物、測序反應液。所述基因檢測試劑盒，還可以包括陰性質控品、陽性質控品、定量標準品、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)、醋醋酸鈉、無水乙醇、甲醯胺等試劑。由於採用了上述的技術方案，本發明中的結合螢光定量PCR的基因測序方法，克服了傳統的基因測序方法的弊端
(1)螢光定量PCR反應時間較定性PCR結合電泳檢測的模式，能縮短廣2個小時；
(2)沒有電泳、切膠純化等長時間操作的步驟，避免了大量PCR產物氣溶膠的產生，降低了假陽性；
(3)螢光信號檢測的靈敏度高於電泳檢測，一般1000拷貝/ml的DNA模板即可被檢測， 並應用於測序，降低了漏檢率；
(4)沒有切膠純化的步驟，避免了PCR產物大量損失的情況；
(5)PCR產物的產量可以通過螢光值予以確定，較電泳圖確認的準確度要高，提高了測序峰圖的質量。基於該方法製備的基因檢測試劑盒，有效的降低了臨床最關注的假陽性問題，能夠廣泛的應用於臨床診斷領域。
圖1是本發明的操作流程圖。圖2是本發明實施例3的螢光定量PCR圖。圖3是本發明實施例3的螢光定量PCR後的電泳圖。圖4是本發明實施例7的測序圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。需要指出的是，以下實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實驗方法， 通常按照常規條件，例如《分子克隆實驗指南》(第三版，科學出版社2002 [美]J.薩姆布魯克，D.W拉塞爾著，黃培堂等譯)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1 引物、探針設計。針對B型肝炎病毒的P基因的高突變區，設計特異性的PCR引物、探針和測序引物，序列如下表所示，並委託專業公司進行合成和螢光標記。
權利要求
1.一種結合螢光定量PCR的基因測序方法，其特徵在於，它包括如下步驟1)螢光定量PCR使用目的片段特異性的引物和螢光探針，對目的片段的核酸模板，進行擴增，得到目的片段的定量結果和PCR產物；2)酶解用外切酶和牛小腸鹼性磷酸酶處理步驟(1)得到的PCR產物，以降解多餘的引物和dNTP，避免對後續反應的幹擾；3)測序反應使用目的片段特異性的測序引物，對步驟(2)得到的酶解產物進行延伸反應，獲得帶螢光標記的測序產物；4)測序產物純化使用醋酸鈉、無水乙醇、甲醯胺處理步驟(3)得到的測序產物，以獲得高純的測序產物；5)測序儀檢測將步驟(4)得到的測序產物上測序儀進行檢測，獲得目的片段的基因序列。
2.一種基於權利要求1所述方法的基因檢測試劑盒，其特徵在於，所述基因檢測試劑盒至少包含如下部分1)用於螢光定量PCR的各反應試劑，至少包括PCR反應液、目的片段特異性的上遊 PCR引物、目的片段特異性的下遊PCR引物、目的片段特異性的螢光探針、耐高溫的DNA聚合酶；2)用於PCR產物酶解的試劑，至少包括外切酶和牛小腸鹼性磷酸酶；3)用於測序反應的試劑至少包括目的片段特異性的測序引物、測序反應液。
3.權利要求2所述基因檢測試劑盒，還可以包括陰性質控品、陽性質控品、定量標準品、尿嘧啶-N-糖基化酶、醋醋酸鈉、無水乙醇、甲醯胺等試劑。
全文摘要
本發明公開了一種結合螢光定量PCR的基因測序方法，它包括螢光定量PCR、酶解、測序反應、測序產物純化、測序儀檢測等步驟。本發明還公開了基於該方法製備基因檢測試劑盒的應用。本發明的方法使用螢光定量PCR代替傳統的定性PCR加電泳的模式對目的核酸進行擴增和擴增效果的檢測，既縮短了檢測時間，又避免了電泳過程中開蓋帶來的PCR氣溶膠汙染問題，降低了假陽性，非常適用於臨床檢測等醫療領域。同時，根據螢光定量PCR對目的片段的定量結果，可以得知目的片段的起始濃度，並大致判斷PCR產物的濃度，可直接指導後續的基因測序，提高了檢測的靈敏度和基因測序的效率。
文檔編號C12Q1/68GK102154502SQ20111009787
公開日2011年8月17日 申請日期2011年4月19日 優先權日2011年4月19日
發明者劉明坤, 葉鋒, 趙洪斌 申請人:北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司