植物硒形態的檢測方法

2023-05-19 15:24:26 2

專利名稱：植物硒形態的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種植物硒形態的檢測方法。
背景技術：
硒是人體必需的微量元素，具有防癌抗癌、清除體內自由基和抗衰老等作用。植物是天然有機硒合成的生化工廠，植物有機硒具有較高的生物利用度和生物活性，衡量硒的生物功能水平不僅與總硒量有關，更與硒的化學形態有關，因此檢測出硒的不同化學形態有其重要的現實意義。植物作為富硒載體可以將無機硒轉化為有機硒，但硒在代謝過程中所需的酶極其複雜，硒的不穩定性等特性又影響著人們對硒形態的進一步認識，目前硒的檢測方法研究從痕量檢測向硒形態檢測的方向發展，因此檢測分析方法實用化、儀器簡單化、標準化是硒形態研究的一個重要方向。近年來，電噴霧質譜(ES-MS)在分析富硒
植物(大蒜、洋蔥、堅果)的硒形態檢測應用較多，但其靈敏度和精確度不高；隨著電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)中碰撞反應池技術的發展，高效液相與電感耦合等離子體質譜HPLC-ICP-MS聯用技術以其較高的分離效率和較低的檢測限，將成為植物硒形態分析的一種新的技術手段，對此經檢索尚未發現有關的資料報導。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種植物硒形態的檢測方法解決上述技術問題採用的技術方案是本植物硒形態的檢測方法按照如下步驟進行(I)檢測前期的準備①選用的設備美國waters公司1525型高效液相色譜儀HPLC，美國ThermoFisher Scientific公司XSeries2電感稱合等離子體質譜儀ICP-MS,離心機,超聲波儀,凍幹機；②HPLC與ICP-MS採用0. 25mm聚醚醚酮PEEK管連接；③選用的試劑鹽酸為分析純，檸檬酸為色譜純，4°C保存的鏈黴蛋白酶E，以上試劑均採購於上海生物工程有限公司；硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)、亞硒酸鈉(Na2SeO3)和硒酸鈉(Na2SeO4)，以上五個硒標準品的純度彡98%,均採購於Sigma公司；④五個砸標準品均用0. lmol/L HCl稀釋為IOOii g/L的混標溶液，4 C保存；試驗中所有試劑的配製均採用MQ為18. 2超純水；(2)建立高效液相色譜與電感耦合等離子體質譜即HPLC-ICP-MS聯用技術①HPLC 的操作參數採用 Hamilton PRP-X100、250_X4. Imm XlOiim 的陰離子柱為色譜柱，流動相為PH4. 725m mo I/L的檸檬酸，進樣量為50y L，流速為I. OmL/min ；②ICP-MS的操作參數採用射頻功率為1300W，冷卻氣流速為13. OL/min，輔助氣流速為0. 8L/min，霧化氣流速為0. 85L/min，碰撞反應池為CCT模式，氫氦混合氣比例為8 92，混合氣流速為6. 95mL/min，測量同位素為78Se ;(3)建立五種硒形態標準溶液的色譜圖取IOOy g/L硒混標溶液，採用步驟(2)HPLC-ICP-MS的操作參數進行檢測，以保留時間Time/ms為橫坐標，響應值Intensity/cps縱坐標，建立五種硒形態標準溶液的色譜圖；(4)植物硒形態的提取與檢測①選取植物材料用超純水洗淨，進行冷凍乾燥、粉碎、過40目篩，並測出含水量，樣品S封放在4 C保存備用；②酶提取法取樣品粉末0. Ig放入15mL離心管中，加入20mg鏈黴蛋白酶E，再加 A 3mL超純水後,37°C超聲提取30min, 14000r/min離心30min,取上清液,過0. 22 y m濾膜2次，待測；③待測樣品按照步驟⑵建立的HPLC-ICP-MS聯用技術進行硒形態的檢測，以保留時間Time/ms為橫坐標,響應值Intensity/cps縱坐標,建立樣品硒形態色譜圖，以採集
圖譜中所示樣品各硒形態對應峰面積計算硒形態的含量
樣品各形態硒濃度(mg/kg )=胃品$液各硒形態濃度X 0.001 X稀釋倍數
稱樣量°本發明的有益效果是創建了一種HPLC-ICP-MS聯用技術，分別檢測出植物中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、亞硒酸鈉和硒酸鈉五種硒形態，樣品的前處理簡便快捷，流動相成分單一，配製簡單，定量結果準確可靠，重複性和精確度良好，可完全滿足植物中硒形態分析的需要，為植物中硒元素的準確定量和形態鑑定提供了切實可行的方法，對富硒植物進一步開發提供了新的理論依據，為預防和緩解我國硒缺乏現狀的整體目標作出一份貢獻。


圖I為本發明的五種硒形態標樣色譜圖。圖2為含硒雷竹筍的硒形態色譜3為圖2的放大色譜圖具體實施方法本發明下面結合實施例予以進一步詳述植物硒形態的測定方法中，設備的選用考慮到的是植物中硒含量極低，檢測設備必須具備較高的精密度和靈敏度，因此採用美國Thermo Fisher Scientific公司的ICP-MS，美國waters公司的HPLC，HPLC與ICP-MS連接採用的PEEK管具有高性能、耐腐蝕、機械性能優良且耐熱性等特點；離心機、超聲儀、凍幹機是常規設備，型號無特殊要求；植物硒化合物種類繁多且含量低，為了保證檢測方法的精確度，具體實施選用的試劑需到達相應的級別(分析純、色譜純、標準品)，鏈黴蛋白酶E需4°C保存避免失活，試劑和樣品配製均採用18. 2MQ超純水；硒的不穩定性是影響著人們對硒形態進一步認識的重要因素，具體實施採用冷凍乾燥前處理樣品和酶解法提取，可以減少硒形態之間相互轉化，確保硒形態定性定量的準確性且效率高。
需說明的是硒標準品的局限性和目標化合物的不可知性一直是困擾硒形態研究的瓶頸問題，本發明優化並創建了一種hplc-icp-ms聯用技術檢測植物中五中硒形態的方法，採用檸檬酸溶液作為流動相分離效果較好，此方法定量結果準確可靠，重複性和精確度良好，可完全滿足植物中硒形態分析的需要。動植物對硒的吸收不僅與總硒的含量有關而且更與硒的形態關係密切，不同化學形態的硒其安全性、生物功能性存在較大差異，植物體中硒形態的深入研究為人類硒源的生物安全性和高效可利用性提供了理論依據。下面以含硒雷竹筍為植物材料採用HPLC-ICP-MS聯用技術檢測其硒形態的情況為例，介紹如下I、檢測前期的準備(I)選用的設備美國raters公司1525型高效液相色譜儀HPLC，美國ThermoFisher Scientific公司XSeries2電感I禹合等離子體質譜儀ICP-MS,日立公司CF16RX離心機，上海之信儀器有限公司JYD-250智能型超聲波儀，美國CHRIST公司ALPHR1-2凍幹機；
(2) HPLC與ICP-MS採用0. 25mm聚醚醚酮PEEK管連接；(3)選用的試劑鹽酸為分析純，檸檬酸為色譜純，4°C保存的鏈黴蛋白酶E，以上試劑均採購於上海生物工程有限公司；硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)、亞硒酸鈉(Na2SeO3)和硒酸鈉(Na2SeO4),以上五個硒標準品的純度彡98%,均採購於Sigma公司；(4)五個硒標準品均用0. lmol/L HCl稀釋為100 U g/L的混標溶液，4°C保存；試驗中所有試劑的配製均採用MQ為18. 2超純水；2、檢測方法(I)建立五種硒形態標準溶液的色譜圖取100 U g/L硒混標溶液，按照HPLC-ICP-MS操作參數(見表I)進樣檢測，以保留時間Time/ms為橫坐標，響應值Intensity/cps縱坐標,建立五種硒形態標準溶液的色譜圖。表1HPLC-ICP-MS 工作參數
權利要求
1.一種植物硒形態的檢測方法，其特徵是按照如下步驟進行 (1)檢測前期的準備 ①選用的設備美國waters公司1525型高效液相色譜儀HPLC，美國ThermoFisherScientific公司XSeries2電感稱合等離子體質譜儀ICP-MS,離心機,超聲波儀,凍幹機； ②HPLC與ICP-MS採用0.25mm聚醚醚酮PEEK管連接； ③選用的試劑鹽酸為分析純，檸檬酸為色譜純，4°C保存的鏈黴蛋白酶E，以上試劑均採購於上海生物工程有限公司；硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)、亞硒酸鈉(Na2SeO3)和硒酸鈉(Na2SeO4)，以上五個硒標準品的純度彡98%,均採購於Sigma公司； ④五個硒標準品均用0.lmol/L HCl稀釋為IOOii g/L的混標溶液，4°C保存；試驗中所有試劑的配製均採用MQ為18. 2超純水； (2)建立高效液相色譜與電感耦合等離子體質譜即HPLC-ICP-MS聯用技術 ①HPLC的操作參數採用HamiltonPRP-X100、250mmX 4. ImmX 10 y m的陰離子柱為色譜柱，流動相為PH4. 72 5m mo I/L的檸檬酸，進樣量為50 u L，流速為I. OmL/min ； ②ICP-MS的操作參數採用射頻功率為1300W，冷卻氣流速為13.OL/min，輔助氣流速為0. 8L/min，霧化氣流速為0. 85L/min，碰撞反應池為CCT模式，氫氦混合氣比例為8 92，混合氣流速為6. 95mL/min，測量同位素為78Se ； (3)建立五種硒形態標準溶液的色譜圖取IOOyg/L硒混標溶液，採用步驟(2)HPLC-ICP-MS的操作參數進行檢測，以保留時間Time/ms為橫坐標，響應值Intensity/cps縱坐標，建立五種硒形態標準溶液的色譜圖； (4)植物硒形態的提取與檢測 ①選取植物材料用超純水洗淨，進行冷凍乾燥、粉碎、過40目篩，並測出含水量，樣品密封放在4°C保存備用； ②酶提取法取樣品粉末0.Ig放入15mL離心管中，加入20mg鏈黴蛋白酶E，再加入3mL超純水後，37 °C超聲提取30min，14000r/min離心30min，取上清液，過0. 22 y m濾膜2次，待測； ③待測樣品按照步驟(2)建立的HPLC-ICP-MS聯用技術進行硒形態的檢測，以保留時間Time/ms為橫坐標，響應值Intensity/cps縱坐標,建立樣品硒形態色譜圖，以採集圖譜中所示樣品各硒形態對應峰面積計算硒形態的含量 樣品各形態硒濃度(mg/kg ):樣口口口鎌獅縣賄X_x獅雛 稱樣量°
全文摘要
一種植物硒形態的檢測方法，按如下四個步驟進行一是檢測前期的準備，確定檢測用的儀器和試劑。二是建立高效液相色譜與電感耦合等離子體質譜即HPLC-ICP-MS聯用技術。三是建立五種硒形態標準溶液的色譜圖。四是植物樣品的預處理及硒形態的提取與檢測，用超純水洗淨待測植物材料，冷凍乾燥、粉碎過濾和測得含水量，密封放在4℃保存備用；或立即用酶在37℃條件下超聲提取30min，離心後取上清液，按照HPLC-ICP-MS聯用技術進行硒形態的檢測，以採集圖譜中所示樣品各硒形態對應峰面積計算植物中硒形態的含量。採用本方法檢測植物硒形態，形態分離完全，樣品前處理簡便快捷，流動相成分單一、配製簡單，重複性和精確度良好，定量結果準確可靠。
文檔編號G01N30/88GK102721779SQ20121021545
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月19日 優先權日2012年6月19日
發明者吳雅瑩, 楊萍, 桂仁意, 湯鋆, 程建中 申請人:浙江農林大學