鋅金屬硫蛋白的生產工藝的製作方法
2023-05-18 18:32:31 5
專利名稱：鋅金屬硫蛋白的生產工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬於金屬硫蛋白的生產工藝。
金屬硫蛋白是1957年發現的，含有鎘及鋅的蛋白質是從馬的腎臟中分離出來的，以後實質相同的蛋白質從兔、牛、羊等動物中分離，馬的金屬硫蛋白的分子量為6000-7000，金屬含量高，它含有61個胺基酸殘基，不含芳香族胺基酸，在61個胺基酸殘基中有20個半胱氨酸，在第一屆金屬硫蛋白國際會議上，確定了具有上述特性並和馬腎的金屬硫蛋白相似的蛋白質為金屬硫蛋白(MT)，由於MT具有的結構特徵，決定了它具有極其重要的生理功能，MT在人體中參與微量元素的儲存、運輸和代射，參與激素和發育過程的調節，增強機體對應激的適應，能夠清除自由基及抗電離輻射等，隨著人們對MT的深入研究，其用途日益廣泛，那麼對於MT的需求，不再是試驗室的方法，一次提取幾十微克，這遠遠不能滿足社會對MT的需求，因此有必要提供一種批量製取金屬硫蛋白的生產工藝。
本發明目的是提供一種批量地生產鋅金屬硫蛋白(ZnMT)的工藝，利用本工藝，可使ZnMT的得率高，生產容易操作，效率高。
為達到上述目的，本發明採用以下幾個步驟(1)誘導將哺乳動物(兔、羊)注射ZnCL2，注射量逐漸上升，注射量在10-80mg/kg體重，誘導期大約8天;(2)粗提將經誘導的動物屠宰取肝，用生理鹽水清洗，稱重，加入予冷的含乙醇的混合液，勻漿、超聲波粉碎，離心分離去沉澱，上清液內滴加予冷的無水乙醇，乙醇最終濃度約75%(體積比)，靜置並離心分離，得沉澱，將沉澱以緩衝液溶解，分離去沉渣，得到棕黃色上清液為乙醇粗提物;(3)柱層析分離上述金屬硫蛋白(MT)，上樣量為柱床體積的20-30%，經洗脫分離，收集第二個無色峰即為含鹽的總金屬硫蛋白(MT);(4)濃縮脫鹽將(3)得到的總MT於超過濾下濃縮脫鹽;(5)分裝、凍幹得產品。
濃縮脫鹽步驟中，除了採用超過濾進行濃縮脫鹽外，還可以通過真空冷凍濃縮，經層析脫鹽。除了上述獲得總MT外，還可以將步驟(3)得到的總MT經真空冷凍濃縮或超濾濃縮後，再按柱床體積的10-20%上層析柱，經緩衝液直線梯度洗脫，收集MT-1，MT-2，然後分別濃縮脫鹽、分裝、凍幹，獲得分型的MT產品。
本發明的優點是本工藝中，採用ZnCl2作為誘導劑，由於ZnCl2無毒性，所用劑量大於CdCl2、ZnSO4等，使得哺乳動物的肝臟產生更多的MT;在破碎上採用組織搗碎和超聲波破碎相結合，有利於MT的提取，可提高MT的得率;為實現批量生產，採用先濃縮後層析分離工藝;利用超過濾濃縮除鹽，減少液態停留時間，降低MT二聚體的聚合率;在成品上採用分裝凍幹，以達到批量生產的目的。
實施例1(1)誘導取家兔一隻，重3kg，於第一、二、四、七天分四次皮下注射ZnCl2懸浮液，每次注射量第一次60mg，第二、三次分別為105mg，第四次150mg，每次體積不大於2ml，於第九天屠宰動物，取肝臟。
(2)粗提肝臟用生理鹽水洗滌後，稱重約100g，加入予冷的混合液55ml，混合液組成是0.01MTris-Hcl，PH8.6無水乙醇氯仿＝1∶00∶1.03∶0.08(體積比)，勻漿5分鐘後，在超聲波下處理5分鐘，4℃，15000g離心30分鐘，除去沉澱。上清液在磁力攪拌下滴加-20℃予冷的無水乙醇，使乙醇最終濃度達75%(體積比)，置20℃冰櫃內過夜(12-20小時)，靜置下吸去上清液約70%，餘下液體離心分離，沉澱用20ml0.01MTris-HclPH8.6緩衝液溶解，再用4℃12000g離心分離去沉渣，棕黃色上清液即為乙醇粗提物(約35ml)。
(3)柱層析分離上述金屬硫蛋白(MT)，由(2)得到的乙醇粗提物直接上用0.01MPH8.6的Tris-Hcl緩衝液平衡好的SephadexG-50柱(4.5×130cm)，上樣量為柱床體積的20-30%，並用同一緩衝液進行洗脫分離，在波長254nm的監測下收集第二個無色的峰，此峰即為含鹽的總金屬硫蛋白(MT)約200ml。
(4)濃縮脫鹽，將(3)得到的總MT於超濾下濃縮脫鹽，使體積達到100ml的濃縮液。
(5)濃縮液經分裝、凍幹得到成品重為140mg。
實施例2(1)誘導取家兔一隻，重4kg，於第一、二、四、七次皮下注射ZnCl2懸浮液，其注射量是第一次100mg，第二、三次160mg，第四次240mg，注射體積不大於2ml。
(2)粗提其操作條件與實施例1相同。
(3)柱層析分離上述金屬硫蛋白(MT)，其操作條件與實施例1相同。
(4)濃縮脫鹽採用真空冷凍乾燥後，加20ml(NH4)2CO3溶解成溶液或真空冷凍濃縮成約20ml溶液，再用0.01M(NH4)2CO3溶液平衡好的SephadexG-50(35×120cm)並以此溶液進行層析脫鹽。
(5)分裝、凍幹製得成品重為150mg。
實施例3(1)、(2)、(3)的操作條件與實施例2相同。
由(3)得到的總金屬硫蛋白(MT)以超濾濃縮30分鐘後，上用0.01M、PH8.6的Tris-Hcl緩衝液平衡好的DEAESepharoseA50柱(或DEAESepharoseFastFlow柱)進行直線洗脫(洗脫液濃度可在0.01M-0.35M之間)，在波長為254nm的監測儀監測下逐一收集MT-1，MT-2峰，然後以實施例1、2方法濃縮脫鹽、分別分裝、凍幹即為成品。
權利要求
1.一種鋅金屬硫蛋白的生產工藝，其特徵在於它包括以下幾個步驟(1)誘導將哺乳動物(兔、羊)注射ZnCl2，誘導期約8天，注射量控制在10mg/kg體重-80mg/kg體重之間，並逐次增大；(2)粗提將經誘導的動物屠宰取肝，用生理鹽水清洗、稱重，加入予冷的含乙醇的混合液，勻漿、超聲波粉碎處理，離心分離去沉澱，上清液內滴加予冷的無水乙醇，控制乙醇的最終濃度約達75%(體積比)，靜置並離心分離，得沉澱，將沉澱以緩衝液溶解，分離去沉渣，得棕黃色上清液為乙醇粗提物；(3)柱層析分離上述金屬硫蛋白(MT)，上樣量為柱床體積的20-30%，經洗脫分離，收集第二個無色峰即為含鹽的總金屬硫蛋白(MT)；(4)濃縮脫鹽將(3)得到的總MT於超過濾下濃縮脫鹽；(5)分裝、凍幹得產品。
2.按權利要求1所述的鋅金屬硫蛋白的生產工藝，其特徵在於所述的予冷的含乙醇的混合液為0.01MTris-Hcl，PH8.6∶無水乙醇∶氯仿＝1.00∶1.03∶0.08(體積比)，其用量為100g肝臟加入50-200ml混合液。
3.按權利要求1所述的鋅金屬硫蛋白的生產工藝，其特徵在於所述的勻漿後用超聲波粉碎3-10分鐘，粉碎的漿液的離心分離採用4℃，10000-20000g離心30分鐘;加無水乙醇後的離心分離採用4℃，10000-20000g離心分離。
4.按權利要求1所述的鋅金屬硫蛋白的生產工藝，其特徵在於所述的濃縮脫鹽採用真空冷凍濃縮後，經層析柱層析脫鹽。
5.按權利要求1所述的鋅金屬硫蛋白的生產工藝，其特徵在於所述的由(3)得到的總MT用真空冷凍濃縮或超濾方法濃縮後，按柱床體積的10-20%上層析柱，經緩衝液直線梯度洗脫，收集MT-1、MT-2，然後分別濃縮脫鹽，分裝、凍幹即為分型的產品。
全文摘要
一種鋅金屬硫蛋白的生產工藝，它包括以下幾個步驟(1)誘導將哺乳動物注射ZnCl
文檔編號A23J1/00GK1085045SQ92111198
公開日1994年4月13日 申請日期1992年9月30日 優先權日1992年9月30日
發明者王金琪, 陸靜玫, 薛小平, 王祖榮, 任道生, 李旭, 唐心利 申請人:北京市科學技術研究院