一種耐超高溫液化澱粉酶的製備方法

2023-05-12 00:40:46

一種耐超高溫液化澱粉酶的製備方法
【專利摘要】一種基因重組菌發酵生產輔酶Q10的方法,將NAD激酶基因轉入高效表達還原性輔酶Q10的菌株；所述的重組菌優化的培養條件為：（1）斜面活化；（2）種子培養；（3）發酵培養。本發明通過基因工程手段構建的重組菌，穩定性強，其輔酶Q10產量較出發菌株提高了21.6%，達到1.63g/L，能夠達到工業生產的要求。
【專利說明】一種耐超高溫液化澱粉酶的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種澱粉酶的製備方法，尤其是涉及一種在高溫下仍然有較高活力的用於澱粉液化的澱粉酶的製備方法。
【背景技術】
[0002]澱粉廣泛應用於食品、醫藥、化工、造紙、石油等領域，發展前景非常廣闊。隨著科學技術的不斷發展，澱粉、澱粉糖和澱粉衍生物等新產品的不斷增多及澱粉深加工產品的開發，加快並推動了澱粉產業的發展。
[0003]我國澱粉及澱粉製品行業發展迅速，澱粉總產量以年均10-15%左右的速度遞增，已成為世界最大的澱粉生產國之一，為澱粉深加工產品的開發與生產奠定了相當的物質基礎。
[0004]目前，全世界澱粉的主要來源是玉米、木薯、小麥等。
[0005]現有生產耐高溫液化澱粉酶的方法主要存在以下不足:一是生產成本相對較高；二是製備得到的澱粉酶耐受的溫度很難超過100°c，用於澱粉液化效果不理想；三是多數企業是將發酵液用硫酸銨鹽析或酒精沉澱，經過濾乾燥而成固體澱粉酶，這種產品含有殘渣、硫酸銨等雜質，應用範圍受到限制。

【發明內容】

[0006]本發明要解決的技術問題是，克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種生產成本低，可耐超高溫，產品質量 好的液化澱粉酶的製備方法。
[0007]本發明解決其技術問題採用的技術方案是，一種耐超高溫的液化澱粉酶的製備方法，包括以下步驟:
步聚1，瓊脂培養基接種培養:(I)瓊脂培養基準備:培養基配方為，胰蛋白腖 1.0-1.5 %，酵母膏 0.5-0.7 %, NaCl 0.9-1.1 %，瓊脂 1.8-2.1 %，可溶性澱粉0.25-0.30%，pH6.5-7.0，其餘為水；將所述配料混勻後，放於培養皿中，0.09-0.1lMPaMPa (優選0.1MPa)滅菌30-35min，冷卻到室溫，製成瓊脂復壯培養基，備用；(2)接種與培養:將保存的地衣芽孢桿菌環移取1-2環放於每個培養皿的瓊脂培養基上，置於36°C ±1°C恆溫培養60-70h，取出保存，製成瓊脂培養基菌種；
步聚2，擴大培養:(I)擴大培養基配方:胰蛋白腖1.0-1.5%，酵母膏0.5-0.7%,NaCl
0.9-1.1%，可溶性澱粉 0.25-0.30%，ρΗ6.5-7.0，其餘為水；0.09-0.1lMPa (優選 0.1MPa)滅菌30-35min，冷卻至39-41 °C (優選40°C )，製成擴大培養基，備用；(2)擴大培養方法:取步聚I製成的瓊脂培養基菌種，按擴大培養基重0.8%的接種量，接種到冷卻至39-41°C (優選40°C )的擴大培養基，360C ± 1°C恆溫培養60-70小時，恆溫培養時，不斷攪拌通風，攪拌速度為300-320轉/分鐘，通風量為1.3-1.5立方氣體/升擴大培養基/分鐘，製成擴大培養液；
步聚3，液態發酵製備:(I)液態發酵培養基配方=(NH4)SO40.22-0.27 %, KH2PO40.30-0.37%,CaCl20.015-0.02%，可溶性澱粉 0.25-0.30%，胰蛋白腖 0.35-0.45%，玉米粉 2.9-3.5%, pH6.5-7.0，其餘為水；0.09-0.1lMPa MPa (優選 0.1MPa)滅菌 30_35min，冷卻至39-41°C(優選40°C )，製成液態發酵培養基，備用；⑵液態發酵培養:取步聚2製成的擴大培養液，按液態發酵培養基重2.5-3.5%的接種量，接種到冷卻至39-41°C (優選40°C ) V的液態發酵培養基，360C ± 1°C恆溫培養60-70小時，恆溫培養時，不斷攪拌通風，攪拌速度為300-350轉/分鐘，通風量為1.3-1.5立方氣體/升培養基/分鐘，製成液態發酵液；步聚4，粗濾:往步聚3製成的液態發酵液中添加相當於液態發酵液重4-6%的硅藻土，混合均勻，板框壓濾，得粗濾液；
步聚5，膜濃縮:以微濾膜將步聚4所得粗濾液過濾濃縮至原粗濾液的1/4-1/5 (即IOOkg粗濾液，經膜濃縮後，製得濃縮液25-20kg)，在5-25°C下保存即可。
[0008]所述地衣芽孢桿菌為公知常見微生物(參見《酶製劑工業》下冊，張樹政主編，科學出版社1998年第三次印刷，476頁)。
[0009]澱粉酶活力檢測方法採用BAU法(參見《酶製劑工業》下冊，張樹政主編，科學出版社1998年第三次印刷，485頁)。
[0010]按本發明方法生產的耐超高溫澱粉酶產品質量符合QB/B23061997標準。在不增加生產成本前提下，酶活力達22000-27000u/mL ;最高能耐受117°C高溫。【具體實施方式】
以下結合實施例對本發明作進一步說明，但這些實施例不應理解為對本發明保護範圍的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法所作的修改或替換，均屬於本發明的保護範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，加入的各原料除特別說明外，均為市售產品。
[0011]步聚I，瓊脂培養基接種培養:(I)瓊脂培養基準備，培養基配方:胰蛋白腖1.2g，酵母膏0.6g，NaCl 1.(^，瓊脂2.(^，可溶性澱粉0.288，pH6.8，其餘為水，合計總重100g ;將所述100g配料混勻後，分放於培養皿中，0.1MPa滅菌33min，冷卻至室溫，製成瓊脂復壯培養基，備用；(2)接種與培養:將實驗室保存的地衣芽孢桿菌環移取I環放於每個培養皿的瓊脂培養基上，置於36°C ±1°C恆溫培養65h,取出保存,製成瓊脂培養基菌種；
步聚2，擴大培養:(I)擴大培養基配方:胰蛋白腖60g (1.2%)，酵母膏30g (0.6%),NaCl 50g (1.0%)，可溶性澱粉 14g (0.28%),水 4846g (96.92%)，合計總重 5000g (5kg)，pH6.8 ；0.1MPa滅菌33min，冷卻至40°C，製成擴大培養基，備用；(2)擴大培養方法:取步聚I製成的瓊脂培養基菌種，按擴大培養基重0.8%的接種量，接種到冷卻至40°C的擴大培養基，36°C ±1°C恆溫培養65小時，恆溫培養時，不斷攪拌通風，攪拌速度為310轉/分鐘，通風量為1.位方氣體/升擴大培養基/分鐘，製成擴大培養液；
步聚3，液態發酵製備:(1)液態發酵培養基配方:(NH4) SO40.25 kg, KH2PO4 0.34kg，CaC120.018kg，可溶性澱粉0.28kg，胰蛋白腖0.40 kg,玉米粉3.20kg，水95.512kg,ρΗ6.8，合計總重100kg，0.1MPa滅菌33min，冷卻至40°C，製成液態發酵培養基，備用；(2)液態發酵培養:取步聚2製成的擴大培養液，按相當於液態發酵培養基重3.0%的接種量，接種到冷卻至40°C的所述液態發酵培養基，360C ± 1°C恆溫培養65小時，恆溫培養時，不斷攪拌通風，攪拌速度為330轉/分鐘，通風量為1.位方氣體/升培養基/分鐘，製成液態發酵液；步聚4，粗濾:往步聚3製成的液態發酵液中添加相當於液態發酵液重4-6%的硅藻土，混合均勻，板框壓濾， 得粗濾液；步聚5，膜濃縮:以微濾膜將步聚4所得粗濾液過濾濃縮至原粗濾液的1/5，經膜濃縮後，將濃縮液以塑料桶裝，在室溫(5-25°C)溫度下保存即可。
[0012]製得的液化澱粉酶，按照BAU 法檢測，酶活力達到27000u/mL ;能耐受117°C高溫。
【權利要求】
1.一種耐超高溫的液化澱粉酶的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: 步聚1，瓊脂培養基接種培養:(I)瓊脂培養基準備:培養基配方為，胰蛋白腖 1.0-1.5 %，酵母膏 0.5-0.7 %，NaCl 0.9-1.1 %，瓊脂 1.8-2.1 %，可溶性澱粉0.25-0.30%，pH6.5-7.0，其餘為水；將所述配料混勻後，放於培養皿中，0.09-0.1lMPaMPa滅菌30-35min，冷卻到室溫，製成瓊脂復壯培養基，備用；(2)接種與培養:將保存的地衣芽孢桿菌環移取1-2環放於每個培養皿的瓊脂培養基上，置於36°C 土TC恆溫培養60-70h，取出保存，製成瓊脂培養基菌種； 步聚2，擴大培養:(I)擴大培養基配方:胰蛋白腖1.0-1.5%，酵母膏0.5-0.7%,NaCl 0.9-1.1 %，可溶性澱粉 0.25-0.30 %，ρΗ6.5-7.0,其餘為水；0.09-0.1lMPa,滅菌30-35min，冷卻至39-41°C，製成擴大培養基，備用；(2)擴大培養方法:取步聚I製成的瓊脂培養基菌種，按擴大培養基重0.8%的接種量，接種到冷卻至39-41°C的擴大培養基，36 0C 土 1°C恆溫培養60-70小時，恆溫培養時，不斷攪拌通風，攪拌速度為300-320轉/分鐘，通風量為1.3-1.5立方氣體/升擴大培養基/分鐘，製成擴大培養液； 步聚3，液態發酵製備:(1)液態發酵培養基配方=(NH4)SO40.22-0.27 %, KH2PO40.30-0.37%,CaCl20.015-0.02%，可溶性澱粉 0.25-0.30%，胰蛋白腖 0.35-0.45%，玉米粉 2.9-3.5%, ρΗ6.5-7.0，其餘為水；0.09-0.1lMPa MPa 滅菌 30_35min，冷卻至 39-41。。，製成液態發酵培養基，備用；(2)液態發酵培養:取步聚2製成的擴大培養液，按液態發酵培養基重2.5-3.5%的接 種量，接種到冷卻至39-41°C的液態發酵培養基，36°C 土 1°C恆溫培養60-70小時，恆溫培養時， 不斷攪拌通風，攪拌速度為300-350轉/分鐘，通風量為1.3-1.5立方氣體/升培養基/分鐘，製成液態發酵液； 步聚4，粗濾:往步聚3製成的液態發酵液中添加相當於液態發酵液重4-6%的硅藻土，混合均勻，板框壓濾，得粗濾液； 步聚5，膜濃縮:以微濾膜將步聚4所得粗濾液過濾濃縮至原粗濾液的1/4-1/5，在5-25 °C下保存。
2.如權利要求1所述耐超高溫的液化澱粉酶的製備方法，其特徵在於，步聚I中，瓊脂復壯培養基的滅菌壓力為0.1MPa0
3.如權利要求1或2所述耐超高溫的液化澱粉酶的製備方法，其特徵在於，步聚2中，擴大培養基滅菌的壓力0.1MPa，冷卻至40°C。
4.如權利要求1或2所述耐超高溫的液化澱粉酶的製備方法，其特徵在於，步聚3中，液態發酵培養基的滅菌壓力為0.1MPa MPa，冷卻至40°C。
【文檔編號】C12N9/28GK103614353SQ201310666013
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月11日 優先權日:2013年12月11日
【發明者】林親錄, 袁四嶽, 孫術國, 吳躍, 梁盈, 付湘晉, 肖華西 申請人:湖南湖湘生物科技有限公司