一種沙門氏菌crispr分型方法
2023-05-12 05:00:06 1
一種沙門氏菌crispr分型方法
【專利摘要】本發明提供了一種沙門氏菌的CRISPR分型方法，通過對沙門氏菌的CRISPR1位點和CRISPR2位點之間最新間隔序列的DNA測序，以確定待檢測菌株的CRISPR型別，進而可以進行血清型別的預測。所述方法簡單，快速，費用低，解析度高，與沙門氏菌血清分型結果一致性高，對實驗室設備及軟體要求低，且新的CRISPR型別包含有細菌進化及地域等諸多信息，並可聯合螢光探針等方法實現實時快速檢測，具有推廣應用價值。
【專利說明】—種沙門氏菌CRISPR分型方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種沙門氏菌分子分型方法，屬於分子流行病學領域。
【背景技術】
[0002]沙門氏菌是一類危害人和動物健康的重要致病菌，其菌屬型別繁多，抗原複雜，因此對沙門氏菌的防治造成了極大的困難。沙門氏菌的分子分型能對其進行準確的診斷和溯源，在分子流行病學方面，這種便捷高效且高解析度的分型方法對大規模的流行病檢測和沙門氏菌的進化具有極其重要的意義；在臨床治療方面，由於沙門氏菌會在耐藥和毒力方面具有型別特異性，因此對其準確的分型能在很大程度上對病情的發生發展和轉歸有一個提前的預見作用，且在臨床治療和用藥上也能提供一個可靠的依據。
[0003]此外，對於沙門氏菌的爆發監測是疾病預防控制機構的重要任務之一，但目前的疾病控制機構存在數量不足及高端分型設備不足等諸多問題。這種新型的分型方法由於原理簡單、操作容易、成本低廉且對實驗室的設備及技術人員的要求不高，因此能在更廣泛的範圍內進行疾病的監測和預警，對我國的疾控事業將會起到一個有利的促進作用。
[0004]沙門氏菌菌屬型別繁多，抗原複雜，目前已明確的血清型達2500多種，是引起食源性腹灣的重要病原菌之一；多為點序列分型(Multilocus Sequencing Typing,MLST)技術解析度高、重複性好，但有時不穩定；脈衝場凝膠電泳(Pulsed Field GelElectrophoresis, PFGE)是細菌分型的金標準，其技術解析度高，但比較費時，且對儀器設備要求高，在圖像處理時主觀造成的偏差較難克服。
[0005]成族的規律間隔的短回文重複序列(clustered regularlay interspaced shortpalindromic repeats, CRISPR)是近年來發現的細菌針對卩遼菌體等外源DNA的獲得性免疫系統。CRISPR系統主要由CRISPR簇，前導序列(leader)和CRISPR相關蛋白基因(CRISPR-associated，cas)基因共同組成。CRISPR簇又由一段不連續的同向重複序列(direct repeat, DR)和插入其中的間隔序列(spacer)組成。DR序列在一個CRISPR簇中的大小和序列幾乎相同，其在沙門氏菌中的長度基本為29bp。不同CRISPR系統中間隔序列(spacer)的長度為17_84bp，而沙門氏菌中基本為32bp。研究表明，CRISPR的作用原理為:在噬菌體入侵宿主細胞後，CRISPR系統會從外來的噬菌體序列中選取一段序列加工成新的重複序列與間隔序列(repeat-spacer, R-S序列)後重組到CRISPR族內，使得宿主獲得抵抗相應噬菌體再次入侵的能力。這使得CRISPR系統具有了極其豐富的序列多態性。重要的是，這種CRISPR系統能作為一種記錄細菌與噬菌體相互鬥爭的編年史被穩定的遺傳下來，這不僅能在細菌的分子分型上開闢一個新的領域，還能為我們更好的研究細菌的進化和遷徙史提供一條重要 的線索。
[0006]目前國內外已有利用CRISPR進行細菌分型的相關研究，但由於現存的CRISPR分型方法依據的是對全部CRISPR位點中所有的間隔序列(spacer)進行測序分析後實現的，雖說解析度極高，但這種分型方法費時費力且建立相關資料庫需要的信息量巨大。
[0007]研究發現，間隔序列在細菌進化過程中存在插入和選擇剔除的現象，使得CRISPR結構具有多態性，並且在同一物種的不同菌株間存在一定的差異。因此，CRISPR結構可以作為細菌分型溯源與進化研究的理想位點。目前關於沙門氏菌的CRISPR分型方法國外有4篇有文獻報導(1.Liu, et al.Appl Environ Microbiol77:4520-4526 ;2.Liu, F et al.ApplEnviron Microbiol77:1946-1956.3.Fabre, et al.PLoS 0ne7:e36995.4.Shariat, N.，etal..BMC Microbiol 13:254.)，但由於其分析對象為沙門氏菌兩個CRISPR位點的全部間隔序列(spacer)，甚至有些為了提高其解析度，聯合兩個沙門氏菌毒力基因sseL和fimH，建立了 CRISPR-MLVA的多位點分型系統。但以上關於沙門氏菌的CRISPR分型方法仍具有諸多不足，比如分析的spacer數量繁多，且每個CRISPR結構的spacer數量不等,這都不便於實驗室快速的分子分型，具有耗時，不經濟等缺點。
[0008]沙門氏菌病是感染性腹瀉的主要病原菌之一。世界衛生組織證實沙門氏菌病是當前重新出現的最重要的傳染性疾病之一。近年來，病原微生物的分子分型技術發展較快，如限制性片段長度多態性(RFLP)、擴增片段長度多態性(AFLP)、隨機擴增多態性DNA (RAPD-PCR)、重複性核酸擴增(Rep-PCR)、脈衝場凝膠電泳(PFGE)、多位點序列分析(MLST)、多位點可變數目串聯重複序列分析(MLVA)等，其中一些成熟的高通量且便於推廣應用的分子分型技術，如PFGE、MLST, MLVA已經應用於傳染病爆發流行監測，並在傳染源的追溯、傳播鏈的確認、新的流行菌株的發現、遺傳變異、系統發生分析甚至於疫情的預警預報等方面發揮了重要作用。以上各種分型方法都有利有弊，RFLP方法重複性好、操作簡便，但解析度有限；AFLP方法解析度高、重複性好，但技術難度也很高；RAPD-PCR和Rep-PCR解析度高，但重複性差；PFGE技術解析度高、重複性好，被譽為病原微生物分子分型的「金標準」，但其對專業設 備和軟體要求高，不適合基層疾控單位和設施較簡單的實驗室開展，而且通過分析電泳圖像帶有一定的主觀性，加之不可避免的手動調圖也使得該方法不能很好地進行高通量分析詮釋及數據交換。
【發明內容】
[0009]本發明旨在建立一種十分簡便的沙門氏菌的CRISPR分型方法。所述方法包括以下步驟:
[0010](I)提取待檢測菌株培養物的DNA ；
[0011](2)分別取適量的步驟(1)DNA提取物，進行CRISPR1位點和CRISPR2位點的PCR擴增，其中CRISPR1位點擴增的上遊引物為SEQ ID NO:1，下遊引物選自SEQ ID NO:2-7中的一種；CRISPR2位點擴增的上遊引物為SEQ ID NO:8，下遊引物選自SEQ ID NO:9或SEQID NO:10 ；
[0012](3)分別對步驟⑵所述CRISPRl位點的擴增產物和所述CRISPR2位點的擴增產物的擴增產物進行DNA測序；
[0013](4)確定CRISPR1位點序列和CRISPR2位點序列中的最新間隔序列，根據二者的間隔序列組合確定所述沙門氏菌的CRISPR型別。
[0014]在本發明的一個優選技術方案中，步驟(2)所述的CRISPR1位點擴增用的下遊引物為 SEQ ID NO:2o
[0015]在本發明的另一個優選技術方案中，步驟(2)所述的CRISPR2位點擴增用的下遊引物為 SEQ ID NO:9。[0016]在本發明的一個優選技術方案中，步驟(3)所述的DNA測序為反向引物測序，所用引物為步驟⑵所述PCR擴增的下遊引物。
[0017]在本發明的一個優選技術方案中，步驟⑷所述的最新間隔序列分別為CRISPR1位點和CRISPR2位點的最後兩個重複序列之間的序列。
[0018]如圖1所示，所述最新間隔序列(new spacer)為CRISPR位點最靠近前導序列(leader)的間隔序列，可運用CRISPRdb網站中的CRISPRfinder功能進行CRISPR結構的整理(http: //crispr.u~psud.fr/crispr/),也可直接通過序列分析軟體DNAstar將最靠近下遊引物的一個間隔序列直接找出。
[0019]優選地，所述的最後兩個重複序列由SEQ ID NO:11所示。，通常CRISPR的第一個重複序列為SEQ ID NO: 12所示，其餘重複序列為SEQ ID NO:11所示，而最後兩個重複序列之間的間隔序列即為最新的間隔序列(有關重複序列的類型可見巴斯德資料庫http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/crispr/CRISPRDB.html)。
[0020]可將找出的CRISPRl位點和CRISPR2位點中的最新間隔序列在間隔序列代碼表(來自巴斯德資料庫 http: / / www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/crispr/CRISPRDB.html)中轉化為spacer代碼。隨後將兩個間隔序列代碼按照CRISPR1在前，CRISPR2在後的順序組成一個間隔序列組合，並以此代表改型沙門菌的CRISPR型別。
[0021]本發明方法還可以包括步驟(5)，即，通過待檢測菌株的CRISPR型別確定所述菌株的血清型(CRISPR型別-血清型預測表可見表1)，實現對其血清型的預測。
[0022]本發明方法省時，經濟，解析度高，易於操作，且與沙門氏菌血清分型一致度高，對實驗室設備及軟體要求低，可聯合螢光探針等實現實時快速的檢測，且能通過最新間隔序列的報告探針實現現場快速檢測等優點。在解析度方面較依靠七個管家基因的多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)略高,但花費卻僅有傳統MLST的四分之一(僅需兩個短序列的測序)。
[0023]對於沙門氏菌的爆發監測是疾病預防控制機構的重要任務之一，但目前的疾病控制機構存在數量不足及高端分型設備不足等諸多問題。這種新型的分型方法由於原理簡單、操作容易、成本低廉且對實驗室的設備及技術人員的要求不高，因此能在更廣泛的範圍內進行疾病的監測和預警，對我國的疾控事業將會起到一個有利的促進作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1.沙門氏菌的CRISPR分型示意圖；
[0025]圖2.沙門氏菌CRISPR的PCR擴增電泳圖譜；
[0026]圖3.沙門氏菌血清型分型和CRISPR分型的一致性分析圖；
[0027]圖4A.沙門氏菌PFGE圖譜；
[0028]圖4B.沙門氏菌PFGE圖譜；
[0029]圖5A.MLST分型解析度示意圖；
[0030]圖5B.CRISPR分型解析度示意圖； [0031 ]圖5C.PFGE分型解析度示意圖。
【具體實施方式】[0032]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明權利要求所定義的保護範圍構成任何限制。
[0033]實施例1:82株沙門氏菌的分子分型及血清型預測
[0034]1.菌株:
[0035]此次試驗選取的菌株為我中心保存的來自我國多個地區82株沙門氏菌，已完成傳統血清學鑑定，確定為沙門氏菌，並分屬21種血清型(82株菌傳統血清學分型結果見表2)。
[0036]2.引物合成:選用引物表中擴增範圍最廣的兩對引物Al，A2和BI，B2
[0037]Al(5/ -GTRGTRCGGATAATGCTGCC-3')
[0038]A2(5/ -CGTATTCCGGTAGATBTDGATGG-3')
[0039]BI (5' -GAGCAATACYYTRATCGTTAACGCC-3')
[0040]B2(5/ -GTTGCDATAKGTYGRTRGRATGTRG-3')
[0041]由上海生工公司合成(Sangon Biotech) [0042]3.細菌基因組DNA提取:
[0043]細菌基因組DNA的抽提使用天根公司(Tiangen Biotech)的細菌DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)，按說明書操作。提取的DNA於_20°C保存。
[0044]4.PCR 擴增 CRISPR 位點:
[0045]PCR反應體系:
[0046]
【權利要求】
1.一種沙門氏菌的CRISPR分型方法，所述方法包括以下步驟: (1)提取待檢測菌株培養物的DNA； (2)分別取適量的步驟⑴DNA提取物，進行CRISPR1位點和CRISPR2位點的PCR擴增，其中CRISPR1位點擴增的上遊引物為SEQ ID NO:1，下遊引物選自SEQ ID NO:2_7中的一種；CRISPR2位點擴增的上遊引物為SEQ ID NO:8，下遊引物選自SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10 ； (3)分別對步驟(2)所述CRISPR1位點的擴增產物和所述CRISPR2位點的擴增產物； (4)確定CRISPR1位點序列和CRISPR2位點序列中的最新間隔序列，根據二者的間隔序列組合確定所述沙門氏菌的CRISPR型別。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(2)所述的CRISPR1位點擴增用的下遊引物為SEQ ID NO:2。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(2)所述的CRISPR2位點擴增用的下遊引物為SEQ ID NO:9。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(3)所述的DNA測序為反向引物測序，所用引物為步驟⑵所述PCR擴增的下遊引物。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(4)所述的最新間隔序列分別為CRISPR1位點和CRISPR2位點的最後兩個重複序列之間的序列。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述的最後兩個重複序列由SEQID NO:11所示。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括步驟(5):通過待檢測菌株的CRISPR型別確定所述菌株的血清型。
【文檔編號】C12Q1/04GK103981256SQ201410147709
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月15日 優先權日:2014年4月15日
【發明者】宋宏彬, 邱少富, 李 浩, 李鵬, 易勝傑, 謝靖, 吳志豪, 郝榮章, 王立貴, 柳楠, 楊超傑 申請人:中國人民解放軍疾病預防控制所