一種快速測定金黴素預混劑中金黴素含量的方法與流程

2023-05-12 06:05:37 2

本發明屬於分析測試
技術領域：
，具體涉及一種快速測定金黴素預混劑中金黴素含量的方法。
背景技術：
：金黴素(Chlortetracycline,CTC)是屬於四環素類的一種廣譜抗生素，在醫療、畜牧業和農業上有廣泛的用途。近年來，四環素類抗生素在抗腫瘤、抑制骨形成等方面的研究，拓寬了這類產品在醫藥方面的應用範圍。金黴素預混劑是金黴素生產菌的全發酵液與適量碳酸鈣製成的金黴素鈣鹽，其中的藥物成分主要是金黴素，但是，也含有一些相關的發酵副產物，如四環素等。目前藥典中規定金黴素含量的檢測方法主要採用的是微生物法和高效液相色譜法。微生物法測定金黴素含量的方法、操作繁瑣、耗時長，且影響因素多、要求環境條件高，測試的準確度難以保證，測試的重複性與再現性也相對較差。《中國藥典》公開了採用HPLC法檢測鹽酸金黴素含量及相關物質的具體操作，其中提供了兩種不同的色譜條件：鹼性流動相和酸性流動相，鹼性流動相使用草酸銨、磷酸氫二銨及二甲基甲醯胺的混合溶液，用氨試液調pH為8.3，該方法雖然比微生物法方便、快捷，但是pH8.3的鹼性流動相條件，金黴素在鹼性條件下極不穩定，易氧化降解，而且流動相含有鹽類，鹽類容易結晶吸出，造成儀器系統配件磨損，縮短儀器的壽命；酸性流動相使用高氯酸、水和二甲亞碸混合溶液，高氯酸為強氧化性酸，易腐蝕儀器系統，縮短色譜柱及儀器的壽命。申請號CN201510431875.1，名稱為《高效液相色譜法測定金黴素預混劑含量及相關物質的方法》的專利改用水、磷酸、N,N-二甲基甲醯胺的混合溶液作為流動相，酸性較為溫和，但是該方法僅在一定程度上緩解了結晶鹽類磨損和強氧化性酸腐蝕的問題，並未根本解決，這種含磷酸的流動相長期使用勢必也會腐蝕儀器系統，縮短儀器壽命。此外，高效液相色譜法的檢測費用昂貴，樣品預處理繁瑣，不適用於大量檢測，因此對於金黴素預混劑生產而言，需要一種快速、易行、準確可靠的檢測方法。技術實現要素：本發明針對微生物法和高效液相色譜法存在的不足，提供一種快速測定金黴素預混劑中金黴素含量的方法。本發明採用如下技術方案：一種快速測定金黴素預混劑中金黴素含量的方法，包括以下步驟：S1、標準曲線的繪製1)鹽酸金黴素標準曲線的繪製：取鹽酸金黴素的標準品並配製成一系列效價梯度的標準溶液，每個效價設置多組標準溶液，取其中一組作為第一標準對照組，所述第一標準對照組用於校正的參比溶液，第一標準對照組的處理方式如下：加入n摩爾量的鹽酸；其餘各組作為第一標準實驗組，所述第一標準實驗組的處理方式如下：加入n摩爾量的鹽酸後進行加熱處理；測定各個第一標準實驗組的吸光度並取平均值，然後根據平均吸光度與第一標準實驗組效價的對應關係建立鹽酸金黴素的標準曲線；2)鹽酸四環素標準曲線的繪製：取鹽酸四環素的標準品並配製成一系列效價梯度的標準溶液，每個效價設置多組標準溶液，取其中一組作為第二標準對照組，所述第二標準對照組用於校正的參比溶液，第二標準對照組的處理方式如下：加入體積VEDTA的EDTA混合液，靜置後，再加入n摩爾量的鹽酸；其餘各組作為第二標準實驗組，所述第二標準實驗組的處理方式如下：加入體積VEDTA的EDTA混合液，靜置後，再加入n摩爾量的鹽酸，然後進行同S11)中的加熱處理；測定各個第二標準實驗組的吸光度並取平均值，然後根據平均吸光度與第二標準實驗組效價的對應關係建立鹽酸四環素的標準曲線；S2、金黴素預混劑樣品溶液的配製1)將金黴素預混劑樣品研磨後取M，經溶解處理使樣品中的抗生素成分充分釋放後，過濾取濾液，濾液體積為V0，即得V0的金黴素預混劑樣品溶液；S3、金黴素預混劑樣品溶液總效價的檢測1)設置第一對照組和第一實驗組，第一對照組和第一實驗組各取V1的步驟S2所配製的金黴素預混劑樣品溶液，第一對照組的處理方式同第一標準對照組，第一實驗組的處理方式同第一標準實驗組，第一對照組和第一實驗組均用水稀釋至相同體積V11；2)分光光度計檢測：以第一對照組為參比溶液，校正後，測得第一實驗組的吸光度A；3)計算：對照步驟S1所得鹽酸金黴素的標準曲線，吸光度A對應於效價N1，則金黴素預混劑樣品溶液的總效價R1＝N1×V11/V1；金黴素預混劑樣品的總效價＝V0×R1/M；S4、金黴素預混劑樣品溶液中四環素效價的檢測1)設置第二對照組和第二實驗組，第二對照組和第二實驗組各取V2的步驟S2所配製的金黴素預混劑樣品溶液，第二對照組的處理方式同第二標準對照組，第二實驗組的處理方式同第二標準實驗組，第二對照組和第二實驗組均用水稀釋至相同體積V22；2)分光光度計檢測：以第二對照組為參比溶液，校正後，測得第二實驗組的吸光度B；3)計算：對照步驟S1所得鹽酸四環素的標準曲線，吸光度B對應於效價N2，則金黴素預混劑樣品溶液中的四環素效價R2＝N2×V22/V2；金黴素預混劑樣品中的四環素效價＝V0×R2/M；S5、金黴素預混劑樣品中的金黴素效價RCTC＝V0×R1/M-V0×R2/M；S6、取多個不同金黴素含量的金黴素預混劑樣品，經過步驟S1至S5分別測得金黴素效價RCTC，同時利用高效液相色譜法分別測定金黴素含量，然後將所得金黴素效價RCTC與高效液相色譜法檢測的金黴素含量進行線性擬合，得到回歸方程；S7、取待測金黴素預混劑樣品，經過步驟S1至S5得到金黴素效價RCTC後，代入回歸方程即得該待測金黴素預混劑樣品中的金黴素含量。本發明的檢測原理為：金黴素預混劑樣品溶液中加入鹽酸，其中的金黴素和四環素在酸性條件下，經加熱水浴處理後脫去一分子水而生成黃色的脫水金黴素和黃色的脫水四環素，其顏色深度(對應於分光光度計中測得的吸光度)與效價成正比；本發明中所用的EDTA混合液由氫氧化鈉和乙二胺四乙酸二鈉溶於水中配製而成，因此EDTA混合液呈鹼性，加入到金黴素預混劑樣品溶液中，金黴素在鹼性條件下轉化為異金黴素，使金黴素失去在酸性條件下顯色的性質，然後加鹽酸使四環素在酸性條件下加熱脫去1分子水而生成黃色的脫水四環素，其顏色深度(對應於分光光度計中測得的吸光度)與效價成正比基於以上原理，對標準溶液和金黴素預混劑樣品溶液作出加鹽酸和/或加EDTA混合液的處理，測定吸光度，通過標準溶液建立吸光度和效價的標準曲線，通過測定金黴素預混劑樣品溶液的吸光度，對照標準曲線，得出金黴素預混劑樣品溶液中金黴素和四環素的總效價以及四環素自身的效價，進而計算得到金黴素效價。最後將分光光度計所得金黴素效價與高效液相色譜法測得的金黴素含量進行線性擬合，得到回歸方程，此後對於待測金黴素預混劑樣品，只需測得金黴素效價，即可代入方程得到金黴素含量。本發明的有益效果如下：(1)儀器設備投入少，只需要一臺分光光度計；(2)操作簡便，避免了操作繁瑣，減輕勞動強度；(3)試劑用量少，節約了檢測試劑成本，且所用試劑對人和環境無毒害，減輕了汙水處理負擔；(4)樣品處理及測定程序簡單，便於實現快速檢測，可一次性檢測大量樣品；(5)對於金黴素預混劑檢測的準確度與重現性不低於高效液相色譜法，適合於企業日常生產的連續檢測，準確可靠且經濟實惠。附圖說明圖1為步驟S6中的線性擬合圖；圖2為鹽酸金黴素的紫外-可見吸收光譜圖。具體實施方式為了使本發明的技術目的、技術方案和有益效果更加清楚，下面結合附圖和具體實施例對本發明的技術方案作出進一步的說明。一種快速測定金黴素預混劑中金黴素含量的方法，包括以下步驟：S1、標準曲線的繪製1)鹽酸金黴素標準曲線的建立精確吸取效價為1000u/mL的鹽酸金黴素標準溶液各0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.20mL、1.40mL於七組50mL的容量瓶中，每組3隻容量瓶，分別加入2mol/L的鹽酸溶液5mL，其中一隻容量瓶加蒸餾水稀釋定容、搖勻，作為參比溶液，即第一標準對照組；另兩隻進行100℃、5min的水浴處理，冷卻後加蒸餾水稀釋定容、搖勻，作為第一標準實驗組，測試後取平均值；在分光光度計上選波長440nm，用參比溶液校正，用1cm比色皿，以參比溶液作空白對照測得上述7組中第一標準實驗組的吸光度並取平均值，以效價為縱坐標，以平均吸光度為橫坐標，建立鹽酸金黴素標準曲線；2)鹽酸四環素標準曲線的建立精確吸取1000u/mL鹽酸四環素標準溶液各0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.20mL、1.40mL於七組50mL容量瓶中，每組3隻容量瓶，分別加入EDTA混合液11mL，室溫靜置5min，然後分別加入2mol/L的鹽酸溶液5mL，其中一隻容量瓶加蒸餾水稀釋定容、搖勻，作為參比溶液，即第二標準對照組；另兩隻進行100℃、5min的水浴處理，冷卻後加蒸餾水稀釋定容、搖勻，作為第二標準實驗組，測試後取平均值；在分光光度計上選波長440nm，用參比溶液校正，用1cm比色皿，以參比溶液作空白對照測得上述7組中第二標準實驗組的吸光度並取平均值，以效價為縱坐標，以平均吸光度為橫坐標，建立鹽酸四環素標準曲線；所用EDTA混合液的配製方法如下(下同)：分別稱取分析純氫氧化鈉55克、乙二胺四乙酸二鈉4.55克於燒杯中，加200mL蒸餾水溶解後，稀釋至5000mL，保存於試劑瓶中，備用；S2、金黴素預混劑樣品溶液的配製1)將金黴素預混劑樣品利用粉樣器研磨成粉狀並取Mg於50mL容量瓶中，少量多次加入浸泡劑後並平搖，無氣泡產生後定容，然後超聲波水浴20min，通過浸泡劑和超聲波水浴處理充分促進金黴素和四環素的溶解，取出冷卻至室溫，上述溶解處理的作用在於使樣品中的抗生素成分充分釋放，然後過濾取濾液，濾液體積為V0＝50mL，即得V0＝50mL的金黴素預混劑樣品溶液；所述浸泡劑由水、丙酮和5mol/L的鹽酸按照1000：500：80的體積比混合配製而成；所得金黴素預混劑樣品溶液中金黴素預混劑樣品的濃度為0.004～0.007g/mL；S3、金黴素預混劑樣品溶液總效價的檢測1)設置第一對照組和第一實驗組，第一對照組和第一實驗組各取V1＝0.5mL的步驟S2所配製的金黴素預混劑樣品溶液於兩隻50mL容量瓶中，且各加入2mol/L鹽酸5mL，第一對照組加水稀釋定容、搖勻，第一實驗組進行100℃、5min中的水浴處理後，冷卻，加水稀釋定容、搖勻，V11＝50mL；2)分光光度計檢測：以第一對照組為參比溶液，在波長440nm處校正後，測得第一實驗組的吸光度A；3)計算：對照步驟S1所得鹽酸金黴素的標準曲線，吸光度A對應於效價N1，則金黴素預混劑樣品溶液的總效價R1(u/mL)＝N1×V11/V1＝100N1；金黴素預混劑樣品的總效價(u/g)＝V0×R1/M＝50×R1/M；S4、金黴素預混劑樣品溶液四環素效價的檢測1)設置第二對照組和第二實驗組，第二對照組和第二實驗組各取V2＝1mL的步驟S2所配製的金黴素預混劑樣品溶液於兩隻50mL容量瓶中，且各加入11mL的EDTA混合液，室溫靜置5min後，第二對照組和第二實驗組再各加入2mol/L的鹽酸5mL，然後第二對照組加水稀釋並定容、搖勻；第二實驗組進行100℃、5min中的水浴處理後，冷卻，加水稀釋定容、搖勻，V22＝50mL；2)分光光度計檢測：以第二對照組為參比溶液，在波長440nm處校正後，測得第二實驗組的吸光度B；3)計算：對照步驟S1所得鹽酸四環素的標準曲線，吸光度B對應於效價N2，則金黴素預混劑樣品溶液中的四環素效價R2(u/mL)＝N2×V22/V2＝50N2；金黴素預混劑樣品中的四環素效價(u/g)＝V0×R2/M＝50×R2/M；S5、金黴素預混劑中的藥成分主要為金黴素和四環素，所以金黴素預混劑樣品中的金黴素效價RCTC＝V0×R1/M-V0×R2/M＝50×(R1-R2)/M；S6、取多組不同金黴素含量且不同重量的金黴素預混劑樣品(金黴素含量從13％、15％、20％、22％、25％不等)，經過上述步驟S1至S5測得多組吸光度A和B，並計算得到對應的R1、R2和RCTC，同時利用高效液相色譜法測得每組金黴素預混劑樣品的金黴素含量，然後將所得金黴素效價RCTC與高效液相色譜法檢測的金黴素含量進行線性擬合，以分光光度計檢測的金黴素效價RCTC為橫坐標，高效液相色譜法檢測的金黴素含量為縱坐標，做直線回歸和相關性分析，繪製線性擬合圖如圖1所示，並得到回歸方程：金黴素含量＝-6.570+0.9851×RCTC，相關係數R-Sq＝99.8％。所述多組金黴素預混劑樣品的檢測數據如表1所示。S7、取待測金黴素預混劑樣品，經過步驟S1至S5得到金黴素效價RCTC後，代入回歸方程即得待測金黴素預混劑樣品中的金黴素含量。表1多組金黴素預混劑樣品的檢測數據匯總註：樣品編號括號中的百分比指金黴素預混劑樣品中金黴素含量的質量比；效價單位g/kg＝103u/g。本發明選擇在波長440nm處校正，原因在於：經紫外-可見分光光度計檢測(見圖2、表2)，鹽酸金黴素在440nm處有最大吸收峰，故取440nm進行校正。具體的檢測方法如下：(1)配製1000u/mL鹽酸金黴素標準溶液，從中各吸取1mL標準溶液於兩隻50mL容量瓶中，分別加入5mL2mol/mL的鹽酸，其中一隻加蒸餾水定容、搖勻，作為參比溶液，另一隻於100℃水浴加熱5分鐘，取出冷卻至室溫，加水定容、搖勻；(2)採用752N型紫外-可見分光光度計，開機預熱20分鐘，在不同波長處測上述溶液的吸光度，以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標得到的吸收譜圖如圖2所示，吸收數據統計如表2所示：表2鹽酸金黴素標準溶液的紫外-可見吸收數據波長(nm)240400410420430436438440442444446448450吸光度0.000.0050.1530.2300.2720.2860.2880.2900.2890.2880.2870.2800.277波長(nm)452454456458460470480490500510520860--吸光度0.2730.2680.2590.25402460.1950.1400.0880.0650.0400.0230.000--最後所應說明的是：上述實施例僅用於說明而非限制本發明的技術方案，任何對本發明進行的等同替換及不脫離本發明精神和範圍的修改或局部替換，其均應涵蓋在本發明權利要求保護的範圍之內。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp