兩個與陸地棉細胞質雄性不育恢復基因連鎖新標記的開發及應用的製作方法

2023-05-12 06:58:56

專利名稱：兩個與陸地棉細胞質雄性不育恢復基因連鎖新標記的開發及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於棉花育種領域，涉及兩個與陸地棉細胞質雄性不育恢復基因連鎖的新標記引物序列、特異序列和製備技術及應用。利用這些引物序列和特異序列進行棉花三系恢復基因的遺傳鑑定、分子遺傳連鎖圖構建和棉花恢復基因分子標記輔助育種，本發明公開了兩個標記引物序列及擴增DNA片段序列。
背景技術：
利用棉花細胞質雄性不育生產雜交種具有省工、省時和成本低等優點，因此「三系」配套生產棉花雜交種已成為一種必然趨勢。目前國內外已經選育出了哈克尼西棉、三裂棉、異常棉、亞洲棉和陸地棉等不育系，其中哈克尼西棉、三裂棉和陸地棉的不育系實現了三系配套。已有研究表明哈克尼西棉不育胞質對雜種後代的產量有不利影響，在生產應用上沒有取得實質性進展。2005年，本課題組首次研究培育出了第一個國家審定的比常規抗蟲棉增產沈.4%的三系雜交抗蟲棉新品種，在生產上不但解決了棉鈴蟲的危害，而且促使棉花產量大幅度的提高。目前國內外報導了哈克尼西棉、三裂棉、 104-7A和晉A不育系恢復基因的遺傳連鎖的分子標記。Guo等(1998年)使用RAPD-PCR 技術分析(0-613-2RXSimiar^)的BC3回交群體中找到了一個與恢復基因緊密連鎖的標記 0PV-15300，並計算出與恢復基因的重組率為13.0士2. 57%。Lan等(2001年)人同樣也使用了 RAPD-PCR技術，通過分析一對近等基因系HAF277 (恢復系)和DELC0T277 (CMS)，發現了 1個與Rf連鎖的RAPD標記UBC6592，其與Rf遺傳距離為2. 3cM ；這個標記克隆測序後被定位到RFLP高密度圖譜上，連鎖分析表明這個標記與Rf基因的遺傳距離為6. OcM0 Liu等 (2003年)使用BSA和GRA結合的方法，對陸地棉細胞質不育系和恢復系雜交Fl代自交後的F2代群體進行RAPD和SSR篩選，結果找到3個SSR標記和2個RAPD標記與Rf1緊密連鎖，但與恢復基因Rf1沒有共分離，並使用非整倍體將Rf1基因定位在第4條染色體的長臂上。^iang (2001年)使用RAPD標記和BSA分析CMS-D8恢復系，找到了與Rf2緊密連鎖的標記UBCIII3qqq和UBC1885( ，遺傳連鎖分析UBC1885(1(1與Rf2的平均遺傳距離為2. 9cM ；並同另外兩個標記UBC1697Q(^nUBC65915( 共同轉化為STS標記。Feng C D等^)05年)使用 RAPD和BSA技術分析(B416RXArk8518) XArk8518群體(恢復系B416R攜帶有D2-2染色體組上恢復基因Rf1)，發現3個RAPD標記UBC14714QQ，UBC607500和UBC679·與Rf1緊密連鎖，其中 UBC169700 和 UBC16 9800 與 Rf1 的遺傳距離為 4. 5cM，UBC6591500 距離 Rf1 為 2. 7cM，並將其轉化為STS標記。Yin等(2006年)在三個BC1同交群體(不育系親本的遺傳來源為 104-7A)中篩選了 2250對SSR引物，找到5個新的與Rf1基因緊密連鎖的SSR標記，並將前人發表的3個STS標記整合構建了包含有13個與恢復基因相關標記的高精細解析度遺傳圖譜，構建了恢復系的BAC文庫，使用這些標記為探針從BAC文庫中篩選到50個克隆，平均每個克隆的插入片段大小為120Kb，並將遺傳圖譜和物理圖譜緊密聯繫起來，最終將Rf1 基因定位在兩個BAC克隆重疊區域的IOOKb之間。Wang等(2007年)人使用RAPD、AFLP, STS、CAPS和SSR標記技術分析了(D8XSG747) XSG747群體，發現了三個新的RAPD標記 UBC352900,UBC683500,UBC722750 和一個 SSR 標記 CIR17%5(I，並將 UBC72275(I 轉化為 CAPS 標記， 使用PI3R基序設計的保守引物與AFLP組合測試回交群體得到一個PPR-AFLP標記與恢復基因Rf2連鎖，結合9個與Rf2緊密連鎖的分子標記構建了與Rf2緊密連鎖的遺傳圖譜；由於 CIR17 9250與Rf2緊密連鎖，同時又與Rf1緊密連鎖，並推測Rf1和Rf2都定位與D亞染色體組的LGD08連鎖群上(現命名為D5染色體)。李朋波等(2007年)人對晉A衍生的不育系和恢復系組配的分離群體進行遺傳和定位分析，表明『晉A』恢復基因在F2和BC1的分離比例分別符合3 1和1 1，證明恢復基因由1對顯性基因控制，用9個SSR標記和4個 STS標記構建了長度為83. IcM的遺傳圖譜，將恢復基因Rf1定位於第19染色體上(LGD08) 與最近的標記CM042和CIR179分別相距5. 4cM和10. 3cM。而本課題組自主選育的抗蟲三系雜交棉親本P30A細胞質雄性不育系(胞質來源於104-7A)和Y18R恢復系(恢復基因來源於0-613-2R)的遺傳背景均不同於前四者，申請者首次構建了其恢復基因的遺傳圖譜， 從棉花微衛星資料庫搜索單一 EST序列側翼SSR引物，對棉花(P30AXY18R) XP30B回交群體進行育性分析，Mapmaker軟體計算與恢復基因連鎖的遺傳距離，獲得與恢復基因緊密連鎖的新標記MGHES28 ；基於BAC克隆HZ-170-M6右末端序列設計STS引物，長度為505bp，對棉花(P30AXY18R) XP30B回交群體進行育性分析，Mapmaker軟體計算與恢復基因連鎖的遺傳距離，獲得與恢復基因緊密連鎖的新標記STSHY27 ；並將兩個新標記應用於恢復基因的分子鑑定。發明內容本發明的目的在於開發與抗蟲三系雜交棉恢復基因緊密連鎖新的分子標記，將該標記應用於構建恢復基因的遺傳圖譜和分子標記輔助選育優良恢復系。利用該標記有目的的發掘利用新的遺傳基因資源，拓寬恢復譜，提高三系雜交棉優良基因的聚合選擇效率。為實現上述目的，本發明設計以下技術措施 構建棉花(P30AXY18R) XP30B回交群體BC1F1代共369個單株。田間調查育性分離比例，其中可育株為180株，不育株為189株，卡方測驗表明(X2 = 0. 11，P>0.95)，本材料育性恢復基因由一對顯性基因控制。在此基礎上申請者通過作圖開發了兩個新的與恢復基因緊密連鎖的分子標記MGHES28和STSHY27，可以準確的鑑定陸地棉細胞質雄性不育恢復基因Rfl。利用這兩個新標記可用於分子標記輔助選育優良恢復系。1.育性分離群體DNA混合池的構建提取棉花(P30AXY18R) XP30B回交群體BC1F1代共369個單株基因組DNA，分別構建不育DNA混合池和可育DNA混合池，每個混合池由5個單株構成。2.恢復基因分子標記的PCR引物設計申請人:發明的陸地棉細胞質雄性不育恢復基因緊密連鎖分子標記MGHES28引物序列分別為SEQ IDNO :1和SEQ ID NO :2 ;STSHY27引物序列分別為SEQ ID NO 3禾P SEQ ID NO :4。申請人所開發的MGHES28標記擴增的特異DNA片段如序列SEQ ID NO :5所述， STSHY27標記擴增的特異DNA片段如序列SEQ ID NO 6所述。
保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；菌種保存名稱 HZ-170-M6 ；地址北京市朝陽區北辰西路1號院，中國科學院微生物研究所；菌株分類命名 Escherichia coli ；保藏日期2009 年 07 月 3 日；保藏編號CGMCCNo. 3160。3. PCR反應體系的建立EST-SSR 標記分析標準PCR反應體系為20 μ L，組成如下Templatel.OyL
IOXTaq buffer2. 0μ L
dNTP (2. 5mM)1. 6μ L
Forward Primer(10 μ Μ)l.OyL
Reverse Primer(10 μ Μ)l.OyL
Taq 酶(2. 5U/ μ L)0. 5μ L
(MH2O11. 9μ L
Total20 μ L
PCR反應熱循環程序為
1)94°C預變性anin，
2)94°C變性 30s，
3)55°C退火30s，
4)72°C延伸30s，
5)Goto step2,35 cycle ；
6)72°C延伸 7min。
7)4°C保存 STS標記分析
標準PCR反應體系為20 μ L，組成如下 Templatel.OuL
IOXTaq buffer2. 0 μ L
dNTP(2. 5mM)1. 6μ L
Forward Primer(10 μ Μ) 1· 0 μ L Reverse Primer(IOyM) l.OyL Taq 酶(2. 5U/ μ L)0. 5 μ L
ddH2011. 9μ L
Total20 μ L
PCR反應熱循環程序為
1)94°C預變性anin，
2)94°C變性 30s，
3)55°C退火30s，
4)72°C延伸60s，
5)Goto step2,35 cycle
6)72°C延伸 7min。
7)4°C保存
4.擴增產物DNA片段檢測
1)分別以可育DNA混合池和不育DNA混合池為模板，MGHES28和STSHY27 行PCR擴增，產物分別在5. 0%的聚丙烯胺膠和1. 0%的瓊脂糖膠上電泳。
2)聚丙烯胺膠電泳電壓為2000V，預電泳30min，上樣8 μ L，電泳時間lh。
引物進瓊脂糖膠電泳電壓為120V，時間為lh。然後在凝膠成像系統上觀察電泳結果。3)將擴增PCR產物回收測序。5.標記與恢復基因遺傳距離的確定1)以構建好的同交群體不育單株DNA為模板，MGHES^和STSHY27引物檢測重組體個數。2)，統計分析，Mapmaker軟體計算遺傳重組距離。MGHES^標記與恢復基因遺傳距離為2. 4cM0 STSHY27與恢復基因遺傳距離為2. IcM06.標記應用於不同恢復系、保持系和不育系的鑑定1)分別以不同恢復系、保持系和不育系DNA為模板，MGHES^和STSHY27引物進行 PCR擴增。擴增產物分別在5. 0%的聚丙烯胺膠和1. 0%的瓊脂糖膠上電泳。2)聚丙烯胺膠電泳電壓為2000V，預電泳30min，上樣8 μ L，電泳時間lh。瓊脂糖膠電泳電壓為120V，時間為lh。然後在凝膠成像系統上觀察電泳結果。
具體實施方式
實施例1 總DNA的提取參考孫鑫等報導的SDS-CTAB法提取棉花總DNA。1)提取液配製IL 提取液含Tris_HCl (PH8. 0) 0. IMEDTA (PH8. 0)0. 02MNaCl1. 5MPVP40 (w/v)2%CTAB (w/v)2%以上溶液各自溶解後混合，定容到IL ；臨用前加2% β-巰基乙醇。2)稱取0. 3g幼嫩棉花葉片放入2mL離心管裡，加入鋼珠，液氮速凍後，放置於 Genegrid研磨儀上振蕩30s，加入ImL預熱65°C提取緩衝液。顛倒混勻。3)將溶液置於65°C水浴中40min;加等體積氯仿異戊醇Q4 1，V/V)振蕩混勻，4°C離心機12000rpm離心lOmin，將上清轉移到另一離心管中，用氯仿異丙醇 (24 1，V/V)再抽提一次，離心收集上清；4)加入0. 6倍體積的冰預冷的異丙醇，緩慢顛倒離心管混勻，室溫靜置30min。用毛細管將絮狀DNA挑出，或者直接室溫12000rpm離心lOmin，用70%的酒精洗滌1_2次，再用100%酒精洗滌1次，室溫乾燥DNA。5)加 200 μ L TE (IOmM Tris-HCl, 1mM EDTA, ΡΗ8. 0)或者純水(ddH20)，室溫放置 1小時，或者65°C水浴使DNA完全溶解；6)加入20 μ L無DNA酶的RNA酶水(10mg/mL)，37°C保溫1小時，用等體積的酚 氯仿異戊醇05 24 1, V/V)抽提1 2次，將上清轉移到另一個離心管中；7)加0. 1倍體積的3M NaAc (PH5. 2)，2倍體積的冰預冷的無水乙醇，混勻後放置5 分鐘。緩緩水平轉離心管5分鐘，此時將於界面處形成一團粘稠透明的絮狀沉澱用毛細管輕輕鉤出，轉移到1. 5mL的離心管中；或者直接12000rpm離心lOmin，沉澱DNA。8)加lmL70%的酒精洗滌沉澱，IOOOOg離心lOmin，去掉上清，再用70%、100%的酒精各洗沉澱一次，在空氣中使核酸沉澱乾燥；9)用50 μ L的TE重新溶解沉澱，於_20 V或_70 V貯存。
實例2 =EST-SSR標記分析育性分離群體DNA混合池的構建田間調查棉花(P30AXY18R) XP30B回交群體BC1F1代共369個單株育性分離情況，分別掛牌標記可育株和不育株，提取單株基因組DNA，分別構建不育和可育DNA混合池， 每個混合池由5個單株構成。所構建不育和可育DNA混合池用於EST-SSR分子標記分析。PCR反應體系的建立和熱循環程序主要參考Yin等方法。試驗設計如下標準PCR反應體系為20 μ L，組成如下Templatel.OyLIOXTaq buffer2. 0 μ LdNTP(2. 5mM)1. 6μ LForward Primer (10 μ Μ) l.OyLReverse Primer(IOyM) l.OyLTaq 酶(2. 5U/ μ L)0. 5 μ LddH2011. 9μ L_Total20 μ LPCR反應熱循環程序為1)94°C預變性 2min，2) 94 °C 變性 30s，3) 55°C退火 30s，4) 72°C 延伸 30s，5) Go to st印2, 35 cycle ；6)72°〇延伸7111土11。7)4°C 保存引物的篩選從棉花微衛星資料庫下載98對名稱為MGHES的EST-SSR引物，分別以棉花可育 DNA和不育DNA混合池為模板進行PCR擴增，PCR產物在5. 0%的聚丙烯胺膠上電泳。聚丙烯胺膠電泳電壓為2000V，預電泳30min，上樣8 μ L，電泳時間lh。瓊脂糖膠電泳電壓為 120V，時間為lh。然後在凝膠成像系統上觀察電泳結果。回交群體BC1F1分離群體的EST-SSR標記分析用在可育和不育DNA混合池中表現多態性的引物進行BC1F1群體369個單株進行 PCR擴增和聚丙烯胺凝膠電泳，檢測BC1F1群體多態性。EST-SSR引物擴增特異DNA片段的回收測序從聚丙醯胺膠切下PCR擴增的特異DNA片段，用無菌槍頭將膠搗碎，加入50 μ L無菌ddH20溶解於室溫放置1天，然後離心以沉澱膠塊，吸取上清液，加入兩倍體積無水乙醇沉澱過夜。15000rpm離心沉澱DNA，棄廢液，晾乾DNA，加10 μ L無菌ddH20溶解，取1 μ L作模板進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳後，用DNA回收試劑盒回收DNA，送北京中國農科院重大工程開放實驗室測序部測序。
實例3 :STSHY27標記分析育性分離群體DNA混合池的構建田間 查棉花(P30AXY18R) XP30B回交群體BC1F1代共369個單株育性分離情況，分別掛牌標記可育株和不育株，提取單株基因組DNA，分別構建不育和可育DNA混合池，每個混合池由5個單株構成。所構建不育和可育DNA混合池用於EST-SSR分子標記分析。PCR反應體系的建立和熱循環程序主要參考Yin等方法。試驗設計如下標準PCR反應體系為20 μ L，組成如下Templatel.OyLIOXTaq buffer2. 0 μ LdNTP(2. 5mM)1. 6μ LForward Primer(IOyM) l.OyLReverse Primer(IOyM) l.OyLTaq 酶(2. 5U/μ L)0. 5 μ LddH2011. 9μ L_Total20 μ LPCR反應熱循環程序為1)94°C預變性 2min，2)94°C變性 30s，3) 55°C退火 30s，4) 72°C延伸 60s，5)Go to st印2, 35 cycle ；6)721延伸7111土11。7)4°C 保存引物的篩選根據5個標記所篩選到的21個陽性BAC克隆末端序列設計32對STS引物，擴增片段大小在200 600bp，分別以棉花可育DNA和不育DNA混合池為模板進行PCR擴增，PCR 產物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳。電壓為100V，電泳時間lh。然後在凝膠成像系統上觀察電泳結果(圖2)。回交群體BC1F1分離群體的STS標記分析用在可育和不育DNA混合池中表現多態性的引物進行BC1F1群體369個單株進行 PCR擴增和聚丙烯胺凝膠電泳，檢測BC1F1群體多態性。 STS引物擴增特異DNA片段的回收測序從瓊脂糖凝膠切下PCR擴增特異DNA片段，用DNA回收試劑盒回收DNA，送北京中國農科院重大工程開放實驗室測序部測序。實例4數據分析遺傳分析
共調查了配製(P30AXY18R) XP30B回交群體369個單株的育性，其中180株為可育，記為1 ;189株為不育，記為0。卡方測驗分析，群體分離比符合1 1(X2 = 0. 11，P> 0. 95)，完全符合一對顯性基因模型。遺傳連鎖分析1)將兩個標記對回交群體中34個可育和不育DNA混合池進行PCR擴增，統計重組體個數。MGHES^標記分析回交群體中出現了 17個重組體，可育與不育的比例為 197 172，符合1 1的分離比例。STSHY27標記分析回交群體中出現了 13個重組體，可育與不育的比例為193 176，符合1 1的分離比例。2)將MGHES^和STSHY27標記分析回交群體中出現的特異帶有無情況輸入計算機，運行Mapmaker軟體，計算兩個標記與恢復基因的遺傳距離。結果.MGHES^標記與恢復基因遺傳距離為2. 4cM ；STSHY27與恢復基因遺傳距離為2. IcM(圖3)。實例5分子標記應用於不同恢復系、保持系和不育系的鑑定1)提取不同恢復系(R1，R2，R3，R4，R5)、保持系(B1，B2，B3，B4，B5)和不育系(Al， A2，A3，A4，A5)以及Y18恢復系(Pl)和不育系P30A(P2)的基因組DNA。2)以不同恢復系(R1, R2，R3，R4，R5)、保持系(Bi, B2，B3，B4，B5)和不育系(Al， A2，A3，A4，A5)的基因組DNA為模板，MGHES28和STSHY27引物分別進行PCR擴增。擴增產物分別在5. 0%的聚丙烯胺膠和1. 0%的瓊脂糖膠上電泳。2)聚丙烯胺膠電泳電壓為2000V，預電泳30min，上樣8 μ L，電泳時間lh。瓊脂糖膠電泳電壓為120V，時間為lh。然後在凝膠成像系統上觀察電泳結果。3) PCR鑑定結果表明MGHES^和STSHY27引物擴增出特異條帶的為恢復系，未擴增出的為保持系和不育系(圖4和圖5)。


圖1為M =DNA標準分子量；IF :MGHES28引物擴增可育DNA混合池；IS為MGHES28 引物擴增不育DNA混合池；箭頭所指為特異帶。圖2為M =DNA標準分子量；F :STSHY27引物擴增可育DNA混合池；S :STSHY27引物擴增不育DNA混合池；箭頭所指為特異帶。圖3為MGHES^和STSHY27標記與恢復基因的遺傳圖譜。MGHES^標記與恢復基因遺傳距離為2. 4cM, STSHY27與恢復基因遺傳距離為2. IcM0圖4為MGHES^引物在恢復系衍生系、保持系和不育系衍生系的擴增特徵。M =DNA 標準分子量；Pl 親本恢復系Y18 ；P2 親本不育系P30A ；Al A5 5個不育系衍生系；Bl B5 不同保持系衍生系；Rl R5 不同恢復系衍生系。箭頭所指為特異帶。圖5為STSHY27引物在恢復系衍生系、保持系和不育系衍生系的擴增特徵。M =DNA 標準分子量；Pl 親本恢復系Y18 ；P2 親本不育系P30A ；Al A5 5個不育系衍生系；Bl B5 不同保持系衍生系；Rl R5 不同恢復系衍生系。箭頭所指為特異帶。序列表中國農業科學院生物技術研究所棉花細胞質雄性不育恢復基因的分子標記MGHES^正向引物6
PatentIn version 3. 1120DNA人工序列1cctgcaaacg ctattgatcc中國農業科學院生物技術研究所棉花細胞質雄性不育恢復基因的分子標記MGHES^反向引物220DNA人工序列2cccagactgg tgatgatgaa中國農業科學院生物技術研究所棉花細胞質雄性不育恢復基因的分子標記STSHY27正向引物320DNA人工序列3tcagcttcaa gtaccgagca中國農業科學院生物技術研究所棉花細胞質雄性不育恢復基因的分子標記STSHY27反向引物420DNA人工序列4aatagcccca tagccctagc中國農業科學院生物技術研究所MGHES28引物擴增特異DNA片段5233DNA 陸地棉恢復系 Y18R(Gossypium hirsutum)5cctgcaaacg ctattgatcc aaagcttaat atctcctgat cccgaactca attggccgag 60
11
ttcagataca acaacaagtt caggattctg gttatgtattgcagcaaccacaattcgatc120
aacagcaaca accacaacag cagcagcagcagcagcagttcttgcatgctggctggtgca180
cctaggcatt acattcatca tcaccagtctgggttcatcatcaccagtctggg233
〈110〉中國農業科學院生物技術研究所
STSHY27引物擴增特異DNA片段
6
505
DNA
〈213〉陸地棉恢復系 Y18R(Gossypium hirsutum)
〈400>6
tcagcttcaa gtaccgagca acatcccatagttctagtgtactcagacaaccacgatcca60
ttcctgtgtg tcgaagaaaa gctgtggcatcaatatggtagtgatcagacggtggacggt120
gaagatctat tgaagccttg ttcgaatctttaattttttattattgagattttgaaggct180
tattgagaaa tctgaagtga aatttgagaagaggaaaagaggagtcatttggtaatgaca240
attggccaga gaatgccatg aacgatagtgactagagttatggaaaaaaa300
aagggagaag aaaaaaaggg ataaagattcaacagatagtagcaaacttactagtggctc360
tacgttggag gaacaaaatg ttcgtagctaaggtatgtccatttcttcttcttcttcttc420
ttcttcttct tcttcttctt cttcttctctcttttttttattcttttcttcctttttgct480
gccctgctag ggctatgggg ctatt
權利要求
1.兩個與陸地棉細胞質雄性不育恢復基因連鎖新標記MGHES^*STSHY27的開發。其步驟包括a).構建(P30AXY18R)XP30B回交群體BC1F1代共369個單株，田間調查育性分離，可育株為180株，不育株為189株，卡方測驗(X2 = 0. ILP >0. 95)結果表明，可育與不育分離比例為1 1，完全符合一對顯性基因控制的模型。b).SDS-CTAB法提取回交群體BC1F1代共369個單株的棉花葉片基因組DNA。構建可育和不育DNA混合池，每個混合池由5個單株構成。所有構建的可育和不育DNA混合池用於 SSR和STS標記分析。c).MGHES28和STSHY27標記分析回交群體可育和不育DNA混合池，進一步分析回交群體中不育單株出現的重組體。MGHES^和STSHY27標記擴增可育DNA混合池的特異DNA片段回收測序。d).數據分析。
2.兩個新標記MGHES^和STSHY27應用於棉花恢復系的分子鑑定。a)提取不同棉花恢復系0 1，1 2，1 3，1 4和1 5)、保持系(Bi，B2，B3，B4和B5)和不育系 (Al, A2, A3, A4 和 A5)葉片基因組 DNA0b)以不同棉花恢復系(R1,R2，R3，R4和R5)、保持系(Bi, B2，B3，B4和B5)和不育系 (Al, A2, A3, A4和A5)葉片基因組DNA為模板，MGHES28和STSHY27標記進行PCR擴增，產物分別在5. 0%聚丙烯胺和1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。c)MGHES28和STSHY27標記在恢復系中擴增的特異DNA片段可明顯的區分恢復系、保持系和不育系。
3.根據權利要求1的分子標記MGHES28引物，其特徵在於具有SEQID No. 1和SEQ ID No. 2的核苷酸序列。
4.根據權利要求1的分子標記STSHY^引物，其特徵在於具有SEQID No. 3和SEQ ID No. 4的核苷酸序列。
5.根據權利要求1或2或3的分子標記MGHES28，其特徵在於具有SEQID No. 5的核苷酸序列。
6.根據權利要求1或2或4的分子標記STSHY27，其特徵在於具有SEQID No. 6的核苷酸序列。
7.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述分子標記具有SEQID No. 5的核苷酸序列。
8.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述分子標記具有SEQID No. 6的核苷酸序列。
9.用於SSR分析來獲得與棉花細胞質雄性不育恢復基因的分子標記MGHES28引物對， 其特徵在於具有SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2的核苷酸序列。用於STS分析來獲得與棉花細胞質雄性不育恢復基因的分子標記STSHY27引物對，其特徵在於具有SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4的核苷酸序列。
10.根據權利要求9所述用來SSR分析獲得棉花細胞質雄性不育恢復基因分子標記 MGHES28引物對擴增的特異DNA片段。其特徵在於所獲得的分子標記引物對擴增的特異 DNA片段具有SEQ ID No. 5的核苷酸序列。
11.根據權利要求9所述用來STS分析獲得棉花細胞質雄性不育恢復基因分子標記 STSHY27引物對擴增的特異DNA片段。其特徵在於所獲得的分子標記引物對擴增的特異 DNA片段具有SEQ ID No. 6的核苷酸序列。
全文摘要
本發明涉及一種利用SSR和STS技術篩選棉花細胞質雄性不育恢復基因連鎖的分子標記的方法和應用。包括步驟a)構建(P30A×Y18R)×P30B回交群體BC1F1代共369個單株。育性分離比符合1∶1，由一對顯性基因控制。b)SDS-CTAB法提取(P30A×Y18R)×P30B回交群體BC1F1代共369個單株葉片基因組DNA。分別構建可育和不育DNA混合池，每個DNA混合池由5個單株構成。c)SSR分析或STS分析，並同收SSR或STS標記擴增的特異DNA片段測序。d)數據分析。本發明公開了兩個與棉花細胞質雄性不育恢復基因連鎖的新標記，所述分子標記具有SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的核苷酸序列；所述分子標記的引物對具有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2或SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核苷酸序列。另外，本發明也公開了所述棉花細胞質雄性不育恢復基因連鎖分子標記在恢復系分子鑑定中的應用。
文檔編號C12P19/34GK102154413SQ20091015726
公開日2011年8月17日 申請日期2009年7月6日 優先權日2009年7月6日
發明者侯思宇, 張銳, 郭三堆 申請人:中國農業科學院生物技術研究所, 郭三堆