一種等溫核酸擴增晶片的製作方法
2023-05-11 19:52:41
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種能夠應用在法醫學檢測、環境檢測、食品檢測等領域的實時重組酶聚合酶等溫核酸擴增晶片。
背景技術：
微流控技術是現今國際高新科技前沿領域之一，在核酸提取、擴增、檢測研究中的應用取得了快速發展，已逐漸成為核酸研究最有潛力的發展方向之一。它具有微米尺度通道網絡結構的晶片,通過對晶片中皮升至納升級微流體的操縱和控制,實現生物醫學和化學實驗室的集成化分析檢測功能。滑動晶片(SlipChip)技術就是微流控技術的一種，由具有微結構的上下兩塊基片組成,由上層基片加入Reaction buffer mix、Template、鎂離子，通過滑動上層基片實現液體在上下層基片交互轉移從而於反應腔混合所有反應試劑原位擴增。
重組酶聚合酶等溫核酸擴增(RPA)原理：重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA複合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發生鏈交換反應形成並啟動DNA合成，對模板上的目標區域進行指數式擴增。被替換的DNA鏈與單鏈結合蛋白(SSB)結合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非常快，一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產物。探針的引入可以實現RPA擴增的實時監測。整個反應特異性強、靈敏度高、快速高效、鑑定簡便，為法醫學、生態環境、食品等領域的實時診斷檢測應用創造了條件。
然而在目前的滑動晶片領域由於晶片結構所限，普遍存在操作繁瑣、需要反覆進行對照組試驗等問題，不僅浪費人力，同時浪費藥品試劑，提高了成本。
技術實現要素：
本發明的目的是為克服上述問題，提出一種等溫核酸擴增晶片，操作簡便，可實現同時擴增不同的樣品，降低了試驗操作強度，而且節約了樣品和試劑的消耗量，降低了實驗成本。
本發明的技術方案包括相互貼合併能夠相對滑動的上、下兩塊玻璃基片，其中：
上玻璃基片的兩側開設有進樣孔A、B，貼合面凹刻有若干重複單元，包括線型分布、相互間隔設置的馬釘型流道若干、弓型單元若干、矩形單元若干，所述重複結構兩側還分布有進樣孔C、出口通孔A、出口通孔B以及出口通孔C；
下玻璃基片的貼合面凹刻有兩組主流道以及與其對應的若干重複單元，包括若干呈線型分布、相互間隔設置的圓形單元若干、流道A若干、流道B若干；
當上、下兩塊玻璃基片貼合時，貼合面的能夠產生進樣、反應兩種狀態；
進樣狀態由兩組主流道分別實現重複單元間相互連通的1)進樣孔B-馬釘型流道-圓形單元-出口通孔B、2)進樣孔A-流道A-弓型單元-出口通孔A兩組進樣通道，以及由3)進樣孔C-矩形單元-流道B-出口通孔C組成的Template通道；隨著玻璃基片相對滑動，能夠產生由弓型單元、矩形單元填充入圓形單元的反應狀態，此時馬釘型流道與圓形單元、弓型單元與流道A、矩形單元與流道B均相互分離。通過滑動玻璃基片能夠在整體上實現A、B兩種反應物的結合反應，且能夠整合添加模板C，使用方便，降低了試驗操作強度，避免了反覆取用反應試劑，在一定程度上節約了樣品和試劑的消耗量，降低了實驗成本。值得注意的是，為了確保凹刻精度，所有凹刻可以採用紫外光光刻蝕刻法進行，通孔可以由超聲打孔開設。
進一步的，處於進樣狀態時圓形單元、弓型單元、矩形單元的中心依次處於同一豎直方向，此時，僅需縱向移動玻璃基片即可達到反應目的，能夠簡化操作。
更進一步的，弓型單元、矩形單元的數量相等並錯位設置，圓形單元的數量比弓型單元或矩形單元的數量多；進樣孔C、出口通孔A設置於馬釘型流道的豎直下方，出口通孔C設置於弓型單元下方，由於弓形單元與矩形單元錯位設置且數量少於圓形單元，此時，位於兩側的圓形單元能夠形成不添加反應物B或者模板C的若干對照組。
在此基礎上，為了便於觀測、順利排出反應物或模板，圓形單元與出口通孔A的連接處、弓型單元與出口通孔A的連接處以及矩形單元與進樣孔C的連接處分別對應的馬釘型流道、流道A、流道B具有向上的折角；連接出口通孔C的流道B具有向下的折角。
附圖說明
圖1是本發明貼合狀態下重複單元的結構示意圖。
圖2是本發明上玻璃基片貼合面的結構示意圖。
圖2A是本發明上玻璃基片重複單元的結構示意圖。
圖3是本發明下玻璃基片貼合面的結構示意圖。
圖3A是本發明下玻璃基片重複單元的結構示意圖。
具體實施方式
為了使本發明實現的技術手段、創作特徵、達成目的與功效易於明白了解，下面結合圖示以Reaction buffer mix、鎂離子以及Template為例，進一步闡述上述技術方案。
如圖1～3所示的一種等溫核酸擴增晶片，由相互貼合、可滑動的上、下層玻璃基片構成，上、下層玻璃基片為同等大小的矩形，當下層固定時，上層玻璃可相對摩擦滑動。在下層玻璃的貼合面開設兩組主流道1、2以及與其對應的5組重複單元B，包括呈線型分布、相互間隔設置的5個圓形單元B1、5段流道B2、6段流道B3；在上層玻璃的貼合面上開設進樣孔11、22，貼合面凹刻有若干重複單元A，包括線型分布、相互間隔設置的7段馬釘型流道A1、5個弓型單元A2、5個矩形單元A3，所述重複結構兩側還分布有進樣孔3、出口通孔111、出口通孔222以及出口通孔33。具體使用步驟如下：
第一步，所述上層玻璃與下層玻璃貼合初始狀態，第一次進液由上層玻璃基片進樣孔11加入Reaction buffer mix，第二次進液由進樣孔22加入鎂離子、第三次進液由進樣孔3加入Template。至此，所有原位等溫擴增反應的試劑都已加入。
所述上層玻璃滑動到反應位之後，上層玻璃的矩形單元A3與弓形單元A2攜帶反應液進入下層玻璃圓形單元B1完成反應，重複結構A與B形成Reaction buffer mix+鎂離子+Template的四個平行反應組以及兩端的無鎂離子組與無Template組兩個對照組。上層玻璃移動到位後，打開加熱溫控裝置，保持反應溫度為39℃。
每個矩形單元A3容積相同，每個弓形單元A2容積相同，每個圓形單元B1容積相同且容積比為選用34.3：13.7：2。
下層玻璃基片和上層玻璃基片為相同尺寸的正方形玻璃，邊長為75mm，寬為厚為1.2mm。上層玻璃所有進樣口和出口通孔直徑皆為1mm。
反應時間定為20min。本實例中對5個不同DNA樣品進行了等溫擴增，大大縮短了試驗操作時間，降低了試驗操作強度。
以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特徵和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等同物界定。