一種新型殼聚糖納米顆粒及其製備方法

2023-04-24 02:15:16 1

專利名稱：一種新型殼聚糖納米顆粒及其製備方法
技術領域：
本發明專利涉及一種可用於食品工業中製備新型殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆 粒的方法。
背景技術：
酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphop印tides，簡稱CPP)是以牛乳酪蛋白為原料，經 單一酶或複合酶系水解，再經分離純化而得到的含有成簇的磷酸絲氨醯基的肽，在動物小 腸內能與Ca2+結合，阻止磷酸鈣沉澱，使小腸對Ca2+的溶解度大大增加。鈣、鐵、鋅在動物體 內起著重要作用，由於飼料原料中含有大量植酸鹽、纖維素、糖醛酸、藻酸鈉和草酸等，從而 阻礙了動物對鈣、鐵、鋅等礦物質的吸收。CPP可提高鈣、鐵、鋅等礦物質的溶解度從而促進 礦物質的吸收。另外，CPP對動物免疫和繁殖也有著重要作用。殼聚糖近年來被廣泛用做生物醫藥輸送載體，具有很好的生物可降解性、生物相 容性和黏膜吸附性。殼聚糖納米顆粒能夠吸附到黏膜表面，並迅速打開上皮細胞之間緊密 的黏結，避開腸道清除機制，在人體腸道中保留較長時間。完整的殼聚糖納米顆粒能夠被人 體細胞吞噬，從而顯著提高被其包封的活性分子的生物利用率。大量毒理學研究已經證明， 殼聚糖對人體安全，無毒副作用。1992年日本將甲殼素及其衍生物列為功能性食品成分。 因此，殼聚糖是非常理想的製備食品納米材料的原料，可以作為食品功能因子的安全輸送 載體.目前通常使用三聚磷酸鈉交聯殼聚糖的方法製備殼聚糖納米顆粒。但是，作為口服 輸送載體，殼聚糖納米顆粒不耐強酸，在低PH值條件下會迅速解離、降解，導致被輸送營養 物在胃酸環境中遭破壞而不能被靶向輸送至腸道吸收。本發明專利解決其技術問題所採用的技術方案是利用胰蛋白酶水解酪蛋白，通 過PH值選擇性沉澱以及陰離子交換分離、純化得到的富含磷酸基團的酪蛋白磷酸肽。通過 條件優化，選擇合適的PH值條件、殼聚糖/酪蛋白磷酸肽質量比製備新型的殼聚糖_酪蛋 白磷酸肽納米顆粒。由於表面磷酸基團負電荷的作用，殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒在 體內能夠避免酸和酶的降解而具有很強的穩定性，具有一定的靶向和緩釋性能。

發明內容
本發明專利利用胰蛋白酶水解酪蛋白，通過等電點沉澱和陰離子交換樹脂分離純 化功能性酪蛋白磷酸肽。由於表面磷酸基團負電荷的作用，酪蛋白磷酸肽在體內能夠避免 酸和酶的降解而具有很強的穩定性。本專利在國際上首次將製備得到的酪蛋白磷酸肽用 於與殼聚糖相互交聯作用形成以酪蛋白磷酸肽聚集體為核，過量殼聚糖反吸附到其表面的 「芯-殼」納米顆粒結構。這種方法一方面提供了製備殼聚糖納米顆粒的新方法；另一方 面，也為包封和保護生物活性多肽以及活性酶提供了一種溫和、高效而便捷的高分子納米 材料。


圖1.隨著殼聚糖/酪蛋白磷酸肽質量比升高過程中，形成的納米顆粒透射電鏡圖
具體實施例方式1.稱取50g酪蛋白，加入0. 05M的NaOH溶液500mL，用磁力攪拌器持續攪拌，待其 充分溶解後，調節PH至8.0。稱取胰蛋白酶0. 25g，溶於0. 75mL去離子水中。將胰蛋白酶溶 液加入酪蛋白-氫氧化鈉溶液中，充分混勻，置於50°C水浴鍋中恆溫反應，並且不斷以IM的 NaOH溶液調節水解液的pH，使水解液的pH恆定8. 0。當水解液的pH最後一次調回8. 0後， 保持半小時以上不再變化時，認為反應結束。反應結束後，將水解液以沸水浴5min滅酶。 待水解液溫度回到室溫後，用IM的HCl將水解液的pH調至4. 6，以2000r/min離心30min， 取上清液，即為CPP粗提產物。調節CPP初產物pH值至pH8. 9，通過HiPr印column (16/10 QXL, Amersham Biosciences)陰離子交換柱分離純化，並凍幹得到富含磷酸基團的酪蛋白 磷酸肽。2.將殼聚糖溶於1 %的醋酸溶液，濃度為8mg/ml，用NaOH溶液調節pH值至6. 0。3.將酪蛋白磷酸肽以去離子水復溶，濃度為8mg/ml，以HCl溶液調節pH值至6.0。4、在500ml酪蛋白磷酸肽溶液中逐滴滴加殼聚糖溶液，直至殼聚糖與酪蛋白磷酸 肽的質量比為1/5，溶液呈現明顯的乳光。5、將納米顆粒溶液以20000g離心30分鐘，移除上清液，以含0. OlM NaCl的10mMTris-HCl緩衝液將納米顆粒衝洗三次之後，以pH2. 5的HCl溶液將納米顆粒重新分散開。6、將納米顆粒的鹽酸溶液凍幹，製成凍乾粉。
權利要求
一種新型殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒的製備方法，其特徵是殼聚糖與酪蛋白磷酸肽的質量比為1/5，粒徑為100-200nm，Zeta電位為0-30mV。
2.一種新型殼聚糖_酪蛋白磷酸肽納米顆粒的製備方法，通過離交聯反應在室溫下合 成，其特徵是(1)殼聚糖溶於的醋酸溶液；(2)將酪蛋白磷酸肽以去離子水溶解後，調 節溶液PH為6 ； (3)攪拌條件下，在酪蛋白磷酸肽溶液中逐滴滴加殼聚糖溶液，使酪蛋白磷 酸肽與殼聚糖互相交聯，形成納米顆粒，此時溶液呈現乳光。
3.根據權利要求2所述的殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒的製備方法，其特徵是殼聚 糖的醋酸溶液在使用前要加鹼調節PH至6。
4.根據權利要求2所述的殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒的製備方法，其特徵是殼聚 糖是市售產品，分子量為IOOkDa,脫乙醯度為90%。
5.根據權利要求2所述的殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒的製備方法，其特徵是所用 的酪蛋白磷酸肽是酪蛋白以胰蛋白酶水解後經等電點沉澱及陰離子交換樹脂純化後的富 含磷酸基團的多肽。
6.根據權利要求5所述的酪蛋白磷酸肽的製備方法，其特徵是酪蛋白以1 10(w/v) 溶於0.05M的NaOH溶液，調節pH至8.0。加入33% (w/v)胰蛋白酶水溶液，胰蛋白酶與酪 蛋白質量比為1 200，50°C水浴恆溫反應，並且不斷以IM的NaOH溶液調節水解液的pH， 使水解液的PH恆定g. 0。當水解液的pH最後一次調回8. 0後，保持半小時以上不再變化 時，認為反應結束。反應結束後，以沸水浴5min滅酶。水解液溫度回到室溫後，用IM的HCl 將水解液的PH調至4. 6，以2000r/min離心30min，取上清液，即為CPP粗提產物。調節CPP 初產物 PH 值至 ρΗ8· 9，通過 HiPr印 column (16/10 QXL, Amersham Biosciences)陰離子交 換柱分離純化CPP，凍幹後得到富含磷酸基團的酪蛋白磷酸肽。
7.根據權利要求2所述的殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒的製備方法，其特徵是酪蛋 白磷酸肽用去離子水復溶後，要調節PH值至6。
8.根據權利要求2所述的殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒的製備方法，其特徵是殼聚 糖與酪蛋白磷酸肽的最終質量比為1/5，且溶液呈現乳光。
全文摘要
本發明專利是一種可用於食品工業中製備新型殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒的方法。目前通常使用三聚磷酸鈉交聯殼聚糖的方法製備殼聚糖納米顆粒。但作為口服輸送載體，此殼聚糖納米顆粒不耐強酸，導致被輸送營養物在胃酸中遭破壞而不能被靶向輸送至腸道吸收。本發明利用胰蛋白酶水解酪蛋白的產物經分離純化得到酪蛋白磷酸肽，通過條件優化，將酪蛋白磷酸肽與殼聚糖相互交聯形成「芯-殼」納米顆粒結構。由於表面磷酸基團負電荷的作用，殼聚糖-酪蛋白磷酸肽納米顆粒在體內能夠避免酸和酶的降解而具有很強的穩定性，具有一定的靶向和緩釋性能，解決了目前殼聚糖-三聚磷酸鈉納米顆粒作為口服輸送載體易被胃酸降解的問題。
文檔編號C12P21/06GK101838467SQ20101017925
公開日2010年9月22日 申請日期2010年5月21日 優先權日2010年5月21日
發明者孫怡, 曾曉雄, 王舒舒, 胡冰 申請人:南京農業大學