一種利用兩親性殼聚糖微球載體製備固定化脂肪酶的方法

2023-04-24 02:55:26 2

專利名稱：一種利用兩親性殼聚糖微球載體製備固定化脂肪酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種製備固定化脂肪酶的方法，特別是涉及一種利用兩親性殼聚糖微球載體製備固定化脂肪酶的方法。
背景技術：
脂肪酶(EC.3.1.1.3)是一類特殊的醯基水解酶，為應用最廣泛的酶催化劑之一，除了能夠催化甘油酯類化合物的水解之外，還可以用於在非水相中催化酯交換、高聚物合成、多肽合成、立體異構拆分和手性藥物的合成等。南極假絲酵母脂肪酶(CandidaAntarctic lipase B，CALB)是一種重要的脂肪酶，在水解和有機合成反應中具有高度的立體選擇性，對非水溶性和水溶性物質都有很強的催化活性。近年的研究成果表明，CALB在多種類型的反應中都顯示了較其它脂肪酶更為出色的催化性能。脂肪酶價格昂貴，雖然游離酶催化反應技術成熟，但酶不能重複使用，難以實現過程的連續化，工業化成本高而難以推廣。固定化脂肪酶，是非水相催化中的常用形式，可以克服游離酶催化的缺點。應用於非水相中的固定化脂肪酶目前多採用吸附法製備，如諾維信公司生產的Novozyme 435 (吸附固定於大孔丙烯酸樹脂的CALB),但即使在非水相中仍然存在酶從載體上脫落的問題。共價結合法具有酶與載體結合牢固，可長時間連續重複使用的優點，符合工業化應用的要求。構建性能優良的載體往往是酶固定化成功與否的關鍵。研究表明，載體表面接枝手臂分子有利於提高固定化酶活性[Barbara Krajewska.Application of chitin—and chitosan—based materials for enzyme immobilizations:a review.Enzyme and Microbial Technology，2004，25:126-139]，具適當疏水表面的載體比具親水表面的載體更適於用作脂肪酶固定化載體[Petkar M, Lali A, Caimi P,Daminati M.1mmobilization of lipases for non—aqueous synthesis.J Mol CatalB Enzym, 2006，39:83-90]。但 Blanco 等[Blanco R M, Terreros P, Munoz N, et al.Ethanol improves lipase immobilization on a hydrophobic support.Journal ofMolecular Catalysis B: Enzymatic, 2007, 47: 13-20]指出疏水性太強的載體也並不一定是最好的，疏水性太強的表面在與水分子接觸時，其接觸角往往大於90°，導致水相不能進入到內部，因而載體只能在其外部吸附一些酶蛋白，減少了載體的載酶量。殼聚糖是一種性質優良的固定化載體，生物相容性好、無毒、具有許多可供改性且親水的氨基和羥基。然而，目前採用殼聚糖特別是改性殼聚糖微球載體共價固定化脂肪酶的報導還很少，這些研究或未將殼聚糖製備成可大量生產的微米級微球，或是製備的殼聚糖微球未連接手臂分子，也沒考慮到給微球表面提供適當的疏水區，這必然影響到製備高活力的固定化脂肪酶，所以開發性能優良的殼聚糖基脂肪酶固定化載體仍很有必要。基於此，我們以反相懸浮交聯法製備微米級殼聚糖微球樹脂作為固定化載體基體，將殼聚糖微球基質C2位苯甲醛化，引入疏水相互作用基團，再用環氧氯丙烷活化C6位羥基，偶聯四乙烯五胺，製備兼具疏水作用苯基和親水性多胺手臂分子的殼聚糖微球，經偶聯戊二醛後作為酶的共價固定化載體。採用該載體對南極假絲酵母脂肪酶進行固定化，提高固定化酶活力。

發明內容
本發明的目的在於提供一種利用兩親性殼聚糖微球載體製備固定化脂肪酶的方法，以反相懸浮交聯法製備微米級殼聚糖微球樹脂作為固定化載體基體，疏水性基團和親水性手臂分子的引入，極大提高了殼聚糖微球對脂肪酶的固定化效率。本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
一種利用兩親性殼聚糖微球載體製備固定化脂肪酶的方法，所述方法包括:
a.製備兩親性殼聚糖微球載體:該載體基質為微米級殼聚糖微球，將殼聚糖微球基質C2位苯甲醛化，引入疏水相互作用基團，再用環氧氯丙烷活化C6位羥基，偶聯四乙烯五胺，製備兼具疏水作用苯基和親水性多胺手臂分子的殼聚糖微球，具體製備過程如下:
⑴殼聚糖微球基質的製備:將質量分數為5%的殼聚糖溶液與PEG2000充分混合，PEG2000在溶液中的質量百分含量分別為3%，再加入與殼聚糖溶液等體積的液體石蠟及乳化劑span-80，高速攪拌30min使體系成乳液狀，然後加入0.12倍殼聚糖溶液體積的甲醛，攪拌Ih後將乳液倒入10 % Na OH/無水乙醇(V(NaOH): V (無水乙醇)=1:1)的混合液中靜置lh，用二甲苯、乙醇、去離子水充分洗滌，得到粒徑lOOlOOym的殼聚糖微球作為基質；⑵基質微球的基團修飾:稱取殼聚糖微球於甲醇中，滴加苯甲醛，苯甲醛與微球質量比3飛，60°C恆溫振蕩反應l(Tl6h，再加入硼氰化鈉室溫反應12h，抽濾洗滌後將微球浸泡在氫氧化鈉水溶液中、緩慢加入環氧氯丙烷，環氧氯丙烷與微球質量比6 12，50°C振蕩反應5h，抽濾洗滌後將環氧化微球置於乙醇中，加入氫氧化鈉水溶液和四乙烯五胺，四乙烯五胺與微球質量比1(T15，55°C反應6h，抽濾，用蒸餾水充分洗滌，乾燥，得兩親性殼聚糖微球載體；
⑶戊二醛活化:取兩親性殼聚糖微球置於燒瓶中，按5倍氨基摩爾數的量加入戊二醛溶液，以乙醇作為反應介質60°C反應1.5h，抽濾，然後用蒸餾水、pH7.5的磷酸緩衝液洗滌，真空乾燥，得戊二醛活化載體。b.製備固定化脂肪酶:將戊二醛活化載體分散於磷酸緩衝液中，室溫下，力口入脂肪酶，脂肪酶與載體的質量比為0.02、.15:1，固定化溫度為20 401:，固定化時間為2飛h，固定化pH7.5^8.0，在搖床中振蕩2飛h，吸去酶液，用磷酸緩衝液清洗固定化酶至洗液中不含蛋白，所得固定化酶放於4°C冰箱中保存即可。所述的一種利用兩親性殼聚糖微球載體製備固定化脂肪酶的方法，所述的疏水作用基團為苯基，親水性手臂分子為多胺。所述的一種利用兩親性殼聚糖微球載體製備固定化脂肪酶的方法，所述兩親性殼聚糖微球載體的粒徑為IOOlOOiI m。所述的一種利用兩親性殼聚糖微球載體製備固定化脂肪酶的方法，所述苯基密度為1.5-2.2mmol / g載體，氨基密度為2.8_3.6mmol / g載體。本發明的優點與效果是:
本發明製備了一種改性殼聚糖微球作為脂肪酶的共價固定化載體。該載體兼具疏水性基團和親水性手臂分子，即疏水性苯基和親水性多胺手臂分子。利用該載體對脂肪酶固定化後大大提高了殼聚糖微球對脂肪酶的固定化效率，所得到的固定化酶活力回收率高達197%，活力為481.6U/g，是採用未改性聚糖微球的固定化水平的14.8倍。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明進行詳細說明。以下通過實施例對本發明作進一步描述，但本發明的保護範圍不限於此。實施例中所用脂肪酶為南極假絲酵母脂肪酶，採用PNPP法測定脂肪酶的活性，以37°C、pH7.5時，每分鐘產生I U mo I的對硝基苯酚(pNP)所需的酶量為一個酶活力單位(U)。實施例中所用南極假絲酵母脂肪酶活力600(T7000U/g。實施例1.兩親性殼聚糖微球載體的製備:
將120ml質量分數為5%的殼聚糖溶液與3.5gPEG2000充分混合，再加入120ml液體石臘，18滴span-80,高速攪拌30min使體系成乳液狀,然後加入14ml甲醒,攪拌Ih後將乳液倒入10 % NaOH/無水乙醇(V(NaOH): V(無水乙醇)=1:1)的混合液中靜置lh，用二甲苯、無水乙醇、去離子水充分洗滌，篩分得到粒徑lOOlOOym的殼聚糖微球作為基質；
稱取5gCS微球於IOOmL甲醇中，滴加苯甲醛30mL，60°C恆溫振蕩反應16h，再加入硼氰化鈉室溫反應12h，抽濾洗滌後將微球浸泡在適量氫氧化鈉水溶液中、緩慢加入65mL環氧氯丙烷，50°C振蕩反應5h，抽濾洗滌後將環氧化微球置於IOOmL乙醇中，加入IOOmL四乙烯五胺、適量氫氧化鈉水溶液，55 °C反應6h，抽濾，用蒸餾水充分洗滌，乾燥，得終產品多胺化苯甲基殼聚糖微球，即兩親性殼聚糖微球載體。以酸鹼滴定法測定微球的氨基含量為3.3mmol/g0稱取上述兩親性殼聚糖微球置於燒瓶中，加入50%戊二醛溶液20mL，以乙醇作為反應介質60V反應1.5h，抽濾，然後用蒸餾水、pH7.5的磷酸緩衝液洗滌，真空乾燥。實施例2.固定化脂肪酶的製備:` 向裝有0.15g戊二醛活化載體的50mL具塞三角瓶中加入10mLpH7.5的磷酸緩衝液，再加入6mg南極假絲酵母脂肪酶B，室溫下，在搖床中反應3h，吸去酶液，用磷酸緩衝液清洗固定化酶至洗液中不含蛋白，所得固定化酶放於4°C冰箱中保存。該固定化脂肪酶活力481 U/g，活力回收率197%。實施例3.固定化脂肪酶的製備:
向裝有0.15g戊二醛活化載體的50mL具塞三角瓶中加入10mLpH7.5的磷酸緩衝液，再加入12mg南極假絲酵母脂肪酶B，室溫下，在搖床中反應3h，吸去酶液，用磷酸緩衝液清洗固定化酶至洗液中不含蛋白，所得固定化酶放於4°C冰箱中保存。該固定化脂肪酶活力509U/g,活力回收率130%。實施例4.固定化脂肪酶的製備:
向裝有0.15g戊二醛活化載體的50mL具塞三角瓶中加入10mLpH7.5的磷酸緩衝液，再加入18mg南極假絲酵母脂肪酶B，室溫下，在搖床中反應3h，吸去酶液，用磷酸緩衝液清洗固定化酶至洗液中不含蛋白，所得固定化酶放於4°C冰箱中保存。該固定化脂肪酶活力535U/g，活力回收率99.6%。實施例5.固定化脂肪酶的製備:
向裝有0.15g戊二醛活化載體的50mL具塞三角瓶中加入10mLpH7.5的磷酸緩衝液，再加入22.5mg南極假絲酵母脂肪酶B，室溫下，在搖床中反應3h，吸去酶液，用磷酸緩衝液清洗固定化酶至洗液中不含蛋白，所得固定化酶放於4°C冰箱中保存。該固定化脂肪酶活力433 U/g，活力回收率 71%。
權利要求
1.一種利用兩親性殼聚糖微球載體製備固定化脂肪酶的方法，其特徵在於，所述方法包括: a.製備兩親性殼聚糖微球載體:該載體基質為微米級殼聚糖微球，將殼聚糖微球基質C2位苯甲醛化，引入疏水相互作用基團，再用環氧氯丙烷活化C6位羥基，偶聯四乙烯五胺，製備兼具疏水作用苯基和親水性多胺手臂分子的殼聚糖微球，具體製備過程如下: ⑴殼聚糖微球基質的製備:將質量分數為5%的殼聚糖溶液與PEG2000充分混合，PEG2000在溶液中的質量百分含量分別為3%，再加入與殼聚糖溶液等體積的液體石蠟及乳化劑span-80，高速攪拌30min使體系成乳液狀，然後加入0.12倍殼聚糖溶液體積的甲醛，攪拌Ih後將乳液倒入10 % NaOH/無水乙醇(V(NaOH): V (無水乙醇)=1:1)的混合液中靜置lh，用二甲苯、乙醇、去離子水充分洗滌，得到粒徑lOOlOOym的殼聚糖微球作為基質； ⑵基質微球的基團修飾:稱取殼聚糖微球於甲醇中，滴加苯甲醛，苯甲醛與微球質量比3飛，60°C恆溫振蕩反應10~l6h，再加入硼氰化鈉室溫反應12h，抽濾洗滌後將微球浸泡在氫氧化鈉水溶液中、緩慢加入環氧氯丙烷，環氧氯丙烷與微球質量比6 12，50°C振蕩反應5h，抽濾洗滌後將環 氧化微球置於乙醇中，加入氫氧化鈉水溶液和四乙烯五胺，四乙烯五胺與微球質量比1(T15，55°C反應6h，抽濾，用蒸餾水充分洗滌，乾燥，得兩親性殼聚糖微球載體； ⑶戊二醛活化:取兩親性殼聚糖微球置於燒瓶中，按5倍氨基摩爾數的量加入戊二醛溶液，以乙醇作為反應介質60°C反應1.5h，抽濾，然後用蒸餾水、pH7.5的磷酸緩衝液洗滌，真空乾燥，得戊二醛活化載體； b.製備固定化脂肪酶:將戊二醛活化載體分散於磷酸緩衝液中，室溫下，加入脂肪酶，脂肪酶與載體的質量比為0.02 0.15:1,固定化溫度為2(T40°C，固定化時間為2飛h，固定化pH7.5~8.0，在搖床中振蕩2飛h，吸去酶液，用磷酸緩衝液清洗固定化酶至洗液中不含蛋白，所得固定化酶放於4 °C冰箱中保存即可。
2.根據權利要求1所述的一種利用兩親性殼聚糖微球載體製備固定化脂肪酶的方法，其特徵在於，所述的疏水作用基團為苯基，親水性手臂分子為多胺。
3.根據權利要求1所述的一種利用兩親性殼聚糖微球載體製備固定化脂肪酶的方法，其特徵在於，所述兩親性殼聚糖微球載體的粒徑為10~300 u m。
4.根據權利要求1所述的一種利用兩親性殼聚糖微球載體製備固定化脂肪酶的方法，其特徵在於，所述苯基密度為1.5-2.2mmol / g載體,氨基密度為2.8_3.6mmol / g載體。
全文摘要
一種利用兩親性殼聚糖微球載體製備固定化脂肪酶的方法，涉及一種製備固定化脂肪酶的方法，以反相懸浮交聯法製備微米級殼聚糖微球樹脂作為固定化載體基體，將殼聚糖微球基質C2位苯甲醛化，引入疏水相互作用基團，再用環氧氯丙烷活化C6位羥基，偶聯四乙烯五胺，製備兼具疏水作用苯基和親水性多胺分子的殼聚糖微球，經偶聯戊二醛後作為脂肪酶的共價固定化載體。採用該載體對南極假絲酵母脂肪酶B進行固定化，疏水性基團和親水性手臂分子的引入提高了殼聚糖微球對脂肪酶的固定化效率。當每克幹載體投加的酶質量為40mg，室溫，pH7.5的條件下固定南極假絲酵母脂肪酶3h，所得到的固定化酶活力回收率達197％，活力為481.6U/g。
文檔編號C12N11/10GK103074322SQ20131000160
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月4日 優先權日2013年1月4日
發明者朱建星, 王紅豔 申請人:瀋陽化工大學