具有酯酶活性的多肽和重組的酯酶及其用途的製作方法

2023-04-23 18:11:36 2

專利名稱：具有酯酶活性的多肽和重組的酯酶及其用途的製作方法
具有酯酶活性的多肽和重組的酯酶及其用途
本發明涉及具有酯酶活性、特別是具有2-烷基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯 酶活性的新穎多肽，並涉及具有酯酶活性的酶活性重組蛋白質，及其用於 拆分2-垸基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯對映異構體混合物外消旋化合物的用 途。
富含對映異構體的2-烷基-5-滷代戊-4-烯羧酸及其酯是用於製備藥物 (例如用於S-氨基-，羥基-co-芳基鏈垸羧醯胺)的有價值的中間產物，其 具有腎素抑制特性，並可在藥物製備中用作抗高血壓劑。 酯酶通常被用於拆分外消旋化合物和不對稱化。 然而，可商業獲得的適用於製備手性化合物的酯酶非常少。 己知來自豬肝的酯酶提取物僅是製備規模上的。豬肝酯酶(PLE)在很 久以前是從天然來源中分離的，其活性也已知很長時間了(Simonds, J.P. (1919) Amer. J. Physiol. 48， 141; Bamann, E. et al. (1934) Hoppe-Seyler Z. 229, 15; Falconer J.S.肌d Taylor, D.B. (1946) Biochem. J. 40, 831-834)。
為了表徵PLE也已經進行了多種研究(Heymann, E. and Junge, W. (1979) Eur. J. Biochem. 95， 509-518; Lehner， R. and Verger, T. (1997) Biochemistry 36,1861-1868)。此外，已可顯示(例如在WO 01/09079中)，來自豬肝的 酯酶提取物可選擇性地水解甲基5-氯代-2-(l-甲基乙基)-4-戊烯酸鹽的(R)對 映異構體。
然而，來自天然來源如豬肝的這類酯酶提取物的用途伴有缺點。 首先，不同批次的品質不同，從而使得難以優化工業過程。其次，在
藥物製品製造中使用動物來源是人們不期望的，因為病毒和朊蛋白(prion)
的存在不能總被清除。
因為這些原因，需要在微生物中生產具有標準化的品質的重組豬肝酯
對可能的酯酶基因的克隆見例如FEBS Lett. (1991), 293, 37-41所述。
活性豬肝酯酶的第一次功能性表達首次被描述於WO 02/48322中。
WO 2004/055177描述了通過對來自WO 02/48322的seq. ID No. 1的重 組豬肝酯酶(rPLE)進行定點誘變來製備其它重組酯酶。如從WO 2004/055177的描述中和從相同發明人寫作的文章Protein Engineering, 16, 1139-1145, 2003的描述中顯而易見的，選擇對來自WO 02/48322的rPLE 序列的修飾，從而獲得在David et al., (1998) Eur. J. Biochem. 257， 142-148 中公開的重組腸內豬酯酶(PICE)。
對外消旋2-烷基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯的拆分在這些文章的任一中均 未描述。
然而，因為對酯酶(其具有針對2-烷基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯的期望 的立體選擇性活性並可以通過生物技術容易地製備)的需要沒有滿足，所 以提供相應的新穎重組酯酶是本發明的一個目的。
在分離和克隆EBS Lett. (1991), 293， 37-41和WO 02/48322所述的針對 已知的豬肝酯酶(PLE)的基因(作為從來自豬肝的mRNA開始獲得的 cDNA)的嘗試中，除了已知的PLE序列以外，還發現了第二個新穎的酯 酶序列。表達這兩個序列後(其中製備了相應的蛋白質或酯酶，即已知的 rPLE和新穎的、重組的"備選"酯酶(rAPLE))，意外地發現僅rAPLE能 夠選擇性拆分外消旋的2-烷基-5-卣代戊-4-烯羧酸酯。
因此可通過具有酯酶活性的新穎多肽和新穎的重組酯酶(rAPLE)來達 成本發明的目的，所述重組酯酶的胺基酸序列與已知PLE序列在總共548 個胺基酸中有21個不同。新穎的rAPLE與已知的豬腸道羧酸酯酶(PICE) 的胺基酸序列也在總共548個胺基酸中有12個不同。然而，PICE被發現 於豬腸道中。
本發明因此涉及具有酯酶活性的多肽，其包含胺基酸序列SEQ. ID. No. 1。
本發明還涉及具有酯酶活性的新穎的重組蛋白質，其包含胺基酸序列 SEQ. ID. No. 1。
本發明的多肽和重組rAPLE具有立體選擇性地拆分外消旋的式(I)
formula see original document page 6(1)
的2-烷基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯的活性，其中R是d-C6的垸基，&是 CrC4的烷基且X是氯、溴或碘。
如上文所述，具有酯酶活性的本發明的多肽和新穎的重組酯酶rAPLE 與FEBS Lett. (1991), 293, 37-41中公開的已知序列的總計548個胺基酸中 有21個不同，並與來自David et al., (1998) Eur. J. Biochem. 257, 142-148中 公開的已知PICE蛋白的總計548個胺基酸中有12個不同。
本發明的新穎rAPLE蛋白質的序列在以下的胺基酸位置上與PLE蛋 白質的已知序列不同
APLE位置PLE
Glu73Asp
He75Val
Gly76Val
Gly77Glu
Leu80Thr
Arg87Gly
lie92Thr
Pro93Leu
Val129Leu
Ser133Pro
Thr134Met
Leu138Val
Ala139Val
Phe234Leu
Ala236Val
Gly 237 Ala
Phe 286 Leu
Ala 287 Thr
Leu 290 Phe
Pro 294 Gin
Thr 302 Pro
另外，本發明的蛋白質和新穎的重組rAPLE可以是SEQ ID No 1所示 經修飾的序列的形式，所述經修飾的序列可得自例如常見修飾，例如序列 N或C端的一個或多個胺基酸(例如來自a因子信號序列的 GluAlaGluAla)的交換、刪除或附加，或通過與其它蛋白質融合來進行修 飾。
本發明還進一步包括在本發明的酶的蛋白質序列中具有修飾的突變蛋 白質，所述本發明的酶具有合適的活性，尤其是對2-垸基-5-滷代戊-4-烯 羧酸酯的活性。突變蛋白質可通過例如通過已知的誘變技術(隨機誘變、 定點誘變、定向進化、基因改組等)修飾DNA (其編碼本發明的酶)獲 得，使得所述DNA編碼與本發明的酶差異至少一個胺基酸的酶，並隨後 在合適的宿主細胞中表達經修飾的DNA。因此，本發明還包括如SEQ ID， No 1所示的經修飾的DNA序列，其通過上述突變、刪除、延伸、融合獲 得，並編碼具有想要的酯酶活性的酶。
酯酶活性，尤其是2-烷基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯酶活性在本文中被定 義為拆分式(I)的2-垸基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯的外消旋化合物的能力。
本發明的多肽和重組rAPLE可以如下製備
首先，使用合適的試劑盒從豬肝分離mRNA，然後基於mRNA提取 物通過反轉錄產生cDNA。
接著，以GenBank編號No. X63323 (Matsushima et al.， 1991)的已知豬 肝酯酶基因的序列為基礎，製備特異性PCR引物，然後進行擴增及克隆。
這些特異性引物是
引物1: 5'-CA04^7TCATGGCTATCGGGCAGCCAGCCTCGC-3， 引物2: 5'-CCGG^47TCAGCCTCCCCTTCACAGCTCAG-3， 引物中包含編碼PLE蛋白質的合適的核苷酸序列並且專屬地存在於引 物中的部分以粗體表示。
引物的其它序列部分包含例如下列信息限制性內切核酸酶(斜體)
的切割位點或對表達來說重要的序列元件。在本發明的rAPLE製備中該部 分可變化。
然後可通過現有技術的PCR方法用引物1和2進行擴增。
隨後使用PCR產物，通過現有技術方法，來製備表達構建體，所述表 達構建體用於在合適的宿主生物中異源表達所編碼的rAPLE蛋白質。優選 地，PCR產物最初必須被克隆進合適的質粒載體中。
然後將以該方式獲得的重組質粒轉化進合適的宿主例如五sc/^n'c/^ co/z'中。然後對若干得到的克隆的插入物進行測序。
出乎意料的是，其中鑑定了兩組具有不同序列的重組克隆， 一組與根 據Matsushima et al.， (1991) FEBS Lett. 293， 37-41的PLE預期序列100%相 同，還有如SEQ. ID. No. 2所示的新穎的核苷酸序列(APLE序列)表達後得 到本發明的胺基酸序列SEQ. ID. No. 1 。
本發明還涉及編碼本發明的多肽和重組酯酶rAPLE的核酸或核苷酸序列。
例如，這類核酸具有SEQ. ID. No. 2中所示的核苷酸序列。 本發明還涉及下述核苷酸序列，所述核苷酸序列包含編碼本發明多肽
和重組酯酶rAPLE的核苷酸序列，或包含SEQ. ID. No. 2所示的核苷酸序列。
另一種可能性是通過標準化的合成技術(例如使用自動化DNA合成 儀)，來製備對應於本發明核酸序列(其編碼本發明的酯酶)的合適的寡 核苷酸。
對編碼本發明酯酶的核酸序列進行純合成製備尤其有利於在生產藥物 或其中間代謝物時使用，因為由此所述酶不從動物來源獲得。 然後對發現的兩種序列(PLE和APLE序列)進行表達。 已知的豬肝酯酶(PLE， Swiss-Prot ID Q29550)包含N端信號序列和C端 ER駐留信號(retension signal)——最後4個胺基酸HAEL。
為了表達已知的PLE和新穎的APLE，構建了下述載體，其中序列被 引入合適的表達系統中。然後將這些表達構建體轉化進入合適的宿主細胞 中。
本文上下文中的合適宿主細胞是例如微生物、動物細胞系和植物。 原核和真核微生物均可使用。優選的原核宿主(細菌)為Esc/^n'c/n'a co/z' 禾口 來 自5acz'〃w( 例如 5.孤Z rifo 、及/z'cAemybr附z's 、 jB.a/w7/0/1々wq/hcf-e似)、屍set^/omowos (例如P./7womscera、 _P._pwri￡/fl) 或 5V廠e/ tomycw (例如51./z'W&似、S.tewfi ae)屬的菌株。真核微生物是優選 的，真菌是尤其優選的。其例子為 5bcc旨蘭戸s ce溶&ae、 屍z'cAz.a
表達可以是分泌的或細胞內的，以及誘導型的和組成型的。 對於細菌表達而言，可以獲得對物種特異信號的選擇，a.o.作為可商 業獲得的用於蛋白質表達的菌株和載體(例如由如Invitrogen、 Novagen、 New England Biolabs的公司提供的)，所述菌株和載體允許誘導型或組成 型的表達、靶蛋白的細胞內和分泌性定位；另外，可以使用下述技術，所 述技術使得蛋白質能夠正確摺疊或促進該正確摺疊以得到可溶的和活性的 蛋白質。
蛋白質優選以分泌方式表達，在該情況下優選構建下述載體，在所述 載體中PLE禾Q APLE的序列以N末端方式連接到6*. ce/^v&'fle的ce因子信 號序列上。
還可製備其中C端四肽HAEL被額外刪除的構建體，所述四肽如例如 Hardwick et al., (1990) EMBO J. 9, 623-630中所述作為ER保留信號作用。 另一優選的表達是帶有或不帶有ER保留信號的構建體的誘導型表達。
出乎意料的是，具有ER保留信號的構建體也可以被表達並得到 rAPLE，所述rAPLE能夠選擇性拆分外消旋的2-烷基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯。
來自APLE基因核苷酸序列的新穎酯酶rAPLE的胺基酸序列如SEQ ID No. 1所述。
出乎意料的是，已可發現，與己知的rPLE相反，在每種情況下通過 例如在屍.細胞中表達分別編碼APLE和PLE的DNA片斷獲得的 新穎的多肽或rAPLE蛋白質，能夠立體選擇性地拆分外消旋的2-烷基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯。
本發明因此還涉及本發明的具有酯酶活性的多肽和重組酯酶(rAPLE) 用於拆分式(I)
的2-烷基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯的外消旋化合物的用途，所述多肽和 重組酯酶與SEQ ID No. 1所示序列具有至少80%的同一性，其中R為Cr C6的垸基，！^是Q-C4的垸基且X是氯、溴或碘。
本發明具有酯酶活性的多肽和重組酯酶(rAPLE)優選與SEQ ID No. 1 所示蛋白質的序列具有至少90%、尤其優選至少98%的同一性。還可使 用本發明的下述具有酯酶活性的多肽或重組酯酶(rAPLE)，其具有通過常 見修飾例如突變、刪除、延伸、融合獲得的經修飾的SEQ ID. No. 1所示 DNA序列，所述經修飾的DNA序列編碼具有想要的酯酶活性的酶。
在這方面，富含對映異構體的式(II)
的2-垸基-5-滷代戊-4-烯羧酸或其酯(其中R為d-CV烷基，A等於 H、 &或R2，其中Ri可以是Ci-C4的烷基，R2是垸基但不等於R"且X 為氯、溴或碘)是這樣獲得的在存在水或式R20H (其中R2是不等於R^ 的烷基)的醇作為親核體時，通過用本發明的多肽或本發明的rAPLE轉化 式(I)formula see original document page 11
的2-烷基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯(其中R、 R,和X如上文定義)的對 映異構體混合物，以及
a) 對剩餘的下述富含對映異構體的式(II)的2-烷基-5-滷代戊-4-烯羧酸 酯加以分離，所述式中A等於Rp或
b) 如果使用醇作為親核體，那麼對得到的下述富含對映異構體的式(II) 的2-垸基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯加以分離，所述式中A等於R2，或
c) 如果使用水作為親核體，對得到的下述式(II)的2-烷基-5-卣代戊-4-烯羧酸加以分離，所述式中A等於H。
式(II)中的R是d-C6的垸基，例如甲基、乙基、正丙基和異丙基、正 丁基、異丁基和叔丁基、戊基和己基。
CVC4的垸基是優選的，異丙基是尤其優選的。
A為H、 & (其中&是d-C4的垸基，優選是CrC2的烷基，尤其優 選是甲基)或R2 (其中R2為不等於Ri的垸基)。尤其優選地，R2是Cr
C6的綜基o
x為氯、溴或碘，優選氯。
在這方面富含對映異構體的化合物表示顯示出>80%的對映體過量
(ee)、優選〉90%、尤其優選>97%的那些。
另外，本發明的酶可以以任何形式使用。例如作為分散劑、作為溶 液、被固定的、作為粗酶、作為已經通過己知的純化方法的組合得自其來 源的酶、作為具有所需酶活性(天然或通過遺傳活性)的完整細胞(其被 適當固定和/或透化)或處於這類細胞的裂解物中。
用於本發明的轉化的反應溫度通常在0匸和99。C之間，優選10和66 'C之間。反應溶液的pH在4和ll之間，優選6和9之間。
對溶劑的選擇取決於使用的親核體。
如果例如水為親核體，則可以使用的溶劑是水，水和與水混溶的溶劑(例如與醇例如甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇等，二噁烷，四氫呋喃，丙 酮或二甲基亞碸)的混合物或水和與水不混溶的溶劑(例如芳香化合物例 如甲苯、二甲苯等，鏈垸例如己垸、庚垸、環己烷等，醚例如二異丙醚、 甲基叔丁基醚等)的兩相系統。如果親核體是醇，則優選地使用的溶劑是 醇R2OH，其中R2是不等於Ri的烷基。然而，還可能使用醇與有機溶劑
(例如四氫呋喃、庚烷、甲苯、己垸、CH3CN、甲基叔丁基醚等)的混合 物。
酶催化的外消旋化合物拆分發生後，想要的終產物被分離。這可以是 剩餘的富含對映異構體的式(II)的2-垸基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯(其中，A 等於R。，或當水為親核體時是形成的富含對映異構體的式(II)的2-烷基-5-滷代戊-4-烯羧酸(其中，A等於H)，或當醇為親核體時是富含對映異 構體的式(II)的2-烷基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯(其中，A等於R2)。
分離可例如通過常規方法(例如抽提、結晶、柱色譜、蒸餾等)發生。
本發明的方法以多達98%的理論產率和多達〉99%的e.e.得到相應的式 (I)的酸或酯。
實施例1: mRNA分離和cDNA的產生
將來自新鮮宰殺的豬(其得自地方屠宰場)的0.7 g肝在液氮中冷凍 並用研缽勻化，使用Fast Track mRNA抽提試劑盒2.0 (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA)，根據製造商的說明書(Fast Track 2.0試劑盒手冊；version J; 082301; 25-0099)，來分離或抽提被解離的mRNA。抽提提供了 12.9貼 的mRNA總量。
然後使用0.26 該mRNA作為模板，使用用於RT-PCR的 Superscript III First-Strand第一鏈合成系統，根據製造商的說明書來產生 cDNA。
實施例2:從豬肝擴增和克隆cDNA
製備基於GenBank編號No. X63323 (Matsushima et al.， 1991)的豬肝酯
酶基因序列的特異性引物
引物1: 5，-CAGA^rrCATGGCTATCGGGCAGCCAGCCTCGC-3， (SEQ ID No.3)
引物2: 5，-CCGG^7TCAGCCTCCCCTTCACAGCTCAG-3, (SEQ ID No. 4)
與已知的PLE序列同源的鹼基用粗體表示。限制性內切核酸酶的識別 序列用斜體表示。
根據'Phusion High-Fidelity DNA聚合酶，手冊(Finnzymes)，在50 pl混 合物中進行擴增，其中使用1 U husion DNA聚合酶(Finnzymes, Espoo, Finland),用500 ng cDNA作為模板，使用20 pmol每種引物1禾n 2、 5 pi 的dNTP混合物(每種2 mM)，所有都在lxPhusion HF緩衝液中，從在98 'C變性30秒開始，隨後是用於擴增的30個循環(98°C 10秒、68°C 20 秒、72'C1分鐘)和在7(TC孵育8分鐘以製備完整的產物。
該PCR產生了大小為1.8 kb (通過瓊脂糖凝膠電泳測定)的DNA片段。
然後使用Qiaquick試劑盒(Qiagen, Hilden, Germany),根據內含的手冊 純化該PCR產物。
用限制性核酸內切酶EcoRI切割約0.1 pg經純化的PCR產物，並通過 EcoRI切割位點，將其克隆進質粒載體pHILZ和pHIL-D2中。
然後將載體轉化進根據'Current Protocols in Molecular Biology，製備的 TOP10電感受態細胞中。
使用'Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing'試齊lj盒(Applied Biosystems Inc., Forster City, Calif., USA)，對若干個得到的克隆的插入物進 行測序。
藉此鑑定了兩條序列， 一條100%對應於由Matsushima et al.， (1991) FEBS Lett. 293, 37-41公開的預期序列，另一條序列對應於SEQ ID No. 2。
實施例3:引入a因子信號序列和改變C末端
為了能夠對本發明的蛋白質rAPLE和已知蛋白質PLE進行分泌型表
達，構建下述載體，在所述載體中PLE和APLE的序列以N末端方式與克 隆載體pPICZ a (Invitrogen)的o;因子起始序列相連。另外，製備其中C端 四肽HAEL被刪除的構建體。
PCRI:使用EcoRI alpha 1/alpha PLE2引物對來擴增克隆載體pPICZ a; (Invitrogen)的o;因子信號序列。PCR在50 jul混合物(2 ng模板、0.5 pmol 每種引物、0.2 mM dNTPs、 1 U Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)，均在 lxPhusion HF緩衝液中，根據'Phusion High-Fidelity DNA聚合酶，手冊 (Finnzymesp中進行。
在95'C變性3分鐘，隨後在30個循環(95°C 30秒、57°C 30秒、72 "C15秒)中擴增，最終步驟為72'C7分鐘。
PCR II : 使用 PLEalphal/EcoRIPLE+ER2 引物對或 PLEalphal/EcoRIPLE2 (刪除C端HAEL四肽)引物對，從pHILZ質粒擴 增"LE和APLE序列。
再在50iul混合物(2ng模板、0.5 jLimol每種引物、0.2 mM dNTPs、 1 U Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)，均在lxPhusion HF緩衝液中，根據 'Phusion High-Fidelity DNA聚合酶，手冊(Finnzymes))中進行這些PCR。
95°C 3分鐘變性，然後在30個循環(95°C 30秒、57°C 30秒、72°C 15秒)中擴增，最終步驟為72"C7分鐘。
PCR III:使用3 |ul來自PCR I和PCR II的產物，通過無引物PCR將這 兩種產物組合起來。
延伸在45 )ul混合物(0.2 mM dNTPs、 1 U的Phusion DNA聚合酶 (Finnzymes)，均在lxPhusion HF緩衝液中)中進行。
在95'C將反應混合物加熱3分鐘，然後在95°C 30秒和72°C 45秒進 行10個循環。為了擴增這些重疊的延伸產物，加入5 pl引物混合物(3 pi 水、1 jil 5 的EcoRIalphal引物和1 ^ 5 的EcoRIPLE+ER2或 EcoRIPLE2引物)。用20個PCR循環(95°C 30秒、57°C 30秒、72°C 1 分鐘)擴增產物，並在72'C單溫度停止7分鐘。
引物序列
EcoRlalpha1: 5'-TCTTCGAAG/W7TCACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGC-3' (SEQ ID No. 5)
alphaPLE2: 5'-GAGGCTGGCTGCCCAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCG-3'
(SEQ ID No. 6)
PLEalpha1: 5'-AGAGAGGCTGAAGCTGGGCA(3CCAGCCTCGCCG-3' (SEQ ID No. 7)
EcoRIPLE+ER2: 5'-ATGGLACCG/A/A7TCTCACAGCTCAGCATGCTTTATCTTG-3' (SEQ ID No. 8)
EcoRIPLE2: 5'-ATGGLA CCGAA 7TCTCACTTTATCTTGGGTGGCTTCTTTG-3' (SEQ ID No. 9)
與模板具有同源性的區域是粗體，限制性內切核酸酶的識別序列是斜體。
實施例4:對用於在乃'C/^ p^to^中異源表達豬肝酯酶的表達構建體 的構建
使用Qiaquick試劑盒(Qiagen, Hilden， Germany),根據內含的手冊來純 化來自實施例3的重疊延伸PCR產物。使用EcoRI限制性內切核酸酶切割 約O.l ng經純化的PCR產物，並通過EcoRI切割位點將其克隆進質粒載體 pGAPZ A (Invitrogen)中。
藉助於對照切割(例如使用Ncol)，檢查插入物相對於啟動子的正確 方向。
在每種情況下，選擇帶有方向正確的插入物的克隆，對其測序並保存。
按照下文所述，對相應的質粒命名
含有Matsushima et al., (1991) FEBS Lett. 293, 37-41中公開的已知PLE 序列的質粒被稱作pGAPZ A PLE-ER (HAEL四肽被刪除)和pGAPZ A PLE+ER (HAEL四肽仍然存在)。
來自新穎的APLE序列的質粒被稱作pGAPZ A APLE-ER (HAEL四 肽被刪除)和pGAPZ A APLE-ER (HAEL四肽仍然存在)。
實施例5:豬肝酯酶在i^c/ 'a卯stor^中的組成型表達
將質粒pGAPZ A PLE-ER、 pGAPZ A PLE+ER、 pGAPZ A APLE-ER
和pGAPZ A APLE+ER轉化進屍.pastor^ X-33。根據來自Invitrogen的 Pichia Expressions試劑盒的方案說明書來進行轉化。在含有100 mg/1 zeocin的YPD平板(1%酵母提取物、2%蛋白腖、2% D-葡萄糖、2%瓊 脂)上選擇轉化子。在含有100 mg/1 zeocin的YPD平板上對經52個 zeocin抗性的克隆劃線，並將其保存於15%甘油中。
實施例6:對酯酶活性的定量分析
在含有100 mg/1 zeocin的YPD平板上，於3(TC下，對屍.戸5to^轉化 子進行48小時的培養。將細胞挑至Whatman 541硬化的無灰70 mm0濾 紙上並晾乾。用6mgo;-萘基醋酸鹽(Sigma,溶於500 ^丙酮中)、2.5 mg鄰 聯茴香胺(tetrazotized o-dianisidine) (Fast Blue Salt BN, Sigma，溶於125 pl水 中)和5 ml 0.1 M磷酸氫二鉀緩衝液，pH 7的溶液孵育濾紙，以通過顯色反 應來觀察酯酶活性。
在整合了 4種質粒pGAPZ A PLE-ER、 pGAPZ A PLE+ER、 pGAPZ A APLE-ER和pGAPZ A APLE+ER之一的所有轉化子中都檢測到了活性。 這證明了具有酯酶活性的功能蛋白質的表達。為了核實，也以相同方式測 試整合了空載體的克隆。在該情況下，在相當長的反應周期內都未看到顯 著的酯酶活性。
實施例7:與甲基5-氯代-2-a-甲基乙基V4-戊烯酸酯相關的立體選擇 性酯酶活性
在含有100 mg/1 zeocin的YPD平板上，於3CTC下，對實施例6中所 述的屍./ a^on、轉化子進行48小時的培養。將細胞挑至Whatman 541硬化 的無灰70 mm0濾紙上並晾乾。將濾紙與底物溶液A (100 pl外消旋的甲 基5-氯代-2-(l-甲基乙基)-4-戊烯酸酯、200 ^ 0.1 M磷酸二氫鉀緩衝液， pH 8; 150 |il 10 mg/ml酚磺酞；450 |ul DMSO; 650 jil H20)或底物溶液B (與底溶液A相同，但是使用甲基(2S，4E)-5-氯代-2-(l-甲基乙基)-4-戊烯酸 酯代替外消旋化合物) 一起孵育。
由於有針對底物的特異酯酶活性，酯底物水解得到的酸釋放導致pH
降低，這隨後導致酚磺酞指示劑的顏色變黃。
這顯示含有質粒pGAPZ A APLE-ER的轉化子如果在底物溶液A上 測試時在孵育3到4小時後給出信號(菌落周圍黃色)，而使用底物溶液 B時不能發現顯著的轉化(

圖1)。
使用質粒pGAPZ A PLE-ER或pGAPZ A PLE+ER獲得的轉化子在相 同的條件下顯示不與底物溶液A或B反應。
這顯示重組的rAPLE與重組的rPLE具有底物特異性差異，且使用 rAPLE對甲基5-氯代-2-(l-甲基乙基)-4-戊烯酸酯的水解是立體選擇性地針 對(R)對映異構體發生的。
實施例8: SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳
向10 ^可商業獲得的豬肝酯酶或10 pi P. pastoris培養物(在帶蓋2 L Erlenmeyer搖瓶中的250 ml YPD培養基中，於100 rpm和28。C下培養72 小時)的60倍濃縮(Centricon Ultrafiltrations-Spin Columns,來自 Sartorius)的上清液中加入10 |il 2x SDS樣品緩衝液(125 mM Tris-HCl， pH 6.8; 4% SDS， 20%甘油、5%/3-巰基乙醇、0.05%溴酚藍)，所述培養物含有 質粒pGAPZAAPLE-ER或空的pGAPZA質粒(對照菌株)。
樣品已經在95。C加熱5分鐘後，在12.5%的聚丙烯醯胺凝膠(4%成層 膠)上分離蛋白質，用考馬斯亮藍R250染色用於檢測。SDS-PAGE顯 示在具有pGAPZ A APLE質粒的酵母菌株中有具有rAPLE的期望大小 ( 60kDa)的蛋白質條帶，但是在對照菌株中沒有(圖2)。
也被分析以用於比較的可商業獲得的豬肝酯酶在相同尺寸範圍內顯示 出兩條蛋白質條帶(圖2中箭頭)。
實施例9:用AOXl啟動子對豬肝酯酶的誘導表達
用限制性內切核酸酶Xhol切割質粒pGAPZ A PLE-ER、 pGAPZ A PLE+ER、 pGAPZ A APLE-ER和pGAPZ A APLE+ER，並通過XhoI切割 位點將編碼APLE和PLE蛋白質的各片段(其具有或不具有ER保留信 號)克隆進pPIC9載體(Invitrogen)中。通過用限制性內切核酸酶Ncol核實
片段相對於A0X1啟動子的正確方向。與實施例4中命名的質粒類似，具 有AOXl啟動子的載體被稱作pPIC9 PLE-ER、 pPIC9 PLE+ER、 pPIC9 APLE-ER和pPIC9 APLE+ER，用Sail對其進行線性化，並將其轉化進屍. / a飾r^ KM71中。根據來自Invitrogen的Pichia表達試劑盒的說明書進行 轉化以及對His原營養型的選擇。根據來自Invitrogen的Pichia表達試劑 盒的說明書，在完全培養基上對選出的轉化子和KM71菌株進行過夜培 養，並用1%的甲醇誘導48小時。通過實施例7中所述的定量pH-遷移測 定法分析得到的培養物，在每種情況下對混合物中2 pi的培養物進行測 試。與實施例7中針對組成型表達所述的情況相比，誘導型AOXl控制下 的表達導致高得多的與外消旋的甲基5-氯代-2-(l-甲基乙基)-4-戊烯酸酯相 關的rAPLE酶活性。僅在幾分鐘後就可檢測到酚磺酞顏色改變(紅到黃)
(圖3)。出乎意料的是，rAPLE活性與C端ER保留信號HAEL的存在 無關，S卩，甚至表達帶有ER保留信號的rAPLE的細胞也顯示活性。相 反，用於生產rPLE的酵母菌株不具有與外消旋甲基5-氯代-2-(l-甲基乙 基)-4-戊烯酸酯相關的活性。
權利要求
1.具有酯酶活性並顯示胺基酸序列SEQ.ID.No.1的多肽。
2. 具有酯酶活性並顯示胺基酸序列SEQ. ID. No. 1的重組蛋白質。
3. 多肽或重組蛋白質，其顯示與SEQ. ID. No. 1所示胺基酸序列至少 80%的同一性，並具有對式(I)的2-垸基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯進行外消旋拆分的活性，其中R是Cr C6的烷基，Ri是d-C4的烷基，且X是氯、溴或碘。
4. 權利要求1-3中任一項所述的多肽或重組蛋白質，其具有酯酶活 性，其顯示通過常見修飾而被修飾的胺基酸序列，所述常見修飾選自突 變、缺失、插入、延伸和/或融合。
5. 核苷酸序列，其編碼權利要求1所述的多肽或權利要求2所述的重 組蛋白質。
6. 核苷酸序列，其具有SEQIDNo.2所示的序列。
7. 核苷酸序列，其包含權利要求5或6所示的核苷酸序列。
8. 權利要求1、 2、 3或4所述的多肽或重組蛋白質用於對式(1)formula see original document page 2的2-烷基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯進行外消旋拆分的用途，其中R是Cr C6的烷基，Ri是d-C4的垸基，且X是氯、溴或碘。
9.用於製備富含對映異構體的式(II)formula see original document page 3的2-垸基-5-滷代戊-4-烯羧酸或其酯的方法，其中R是d-C6的垸基， A等於H、 &或112，其中R,可以是d-C4的烷基，其中R2是垸基但是不 等於Ri，且X為氯、溴或碘，所述方法包括在存在水或其中R2是不等於 Ri的烷基的式R20H的醇作為親核體時，通過權利要求l、 2、 3或4所述 的多肽或重組酯酶來轉化式(I)的2-垸基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯的對映異構體混合物，其中R、 &和 X如上文定義，以及a) 分離剩餘的下述富含對映異構體的式(II)的2-烷基-5-卣代戊-4-烯羧 酸酯，所述式中A等於Rp或b) 如果使用醇作為親核體，分離得到的下述富含對映異構體的式(n)的2-垸基-5-滷代戊-4-烯羧酸酯，所述式中A等於R"或c) 如果使用水作為親核體，分離得到的下述式(II)的2-烷基-5-滷代戊-4-烯羧酸，所述式中A等於H。
全文摘要
本發明公開了具有酯酶活性的多肽和重組蛋白質(其展示出胺基酸序列SEQ.ID.No.1)及其用途。
文檔編號C12N15/52GK101351548SQ200680049665
公開日2009年1月21日 申請日期2006年12月8日 優先權日2005年12月27日
發明者喬納斯·西基爾科斯, 克里斯多福·贊茲馬爾, 哈拉德·皮希勒, 彼得·波亞爾裡爾, 格哈德·斯坦保爾, 沃夫岡·斯卡安可, 赫爾馬特·施瓦布, 麥可·施塔內克, 馬塞爾·烏博爾特斯, 馬諾拉·埃爾曼 申請人:Dsm精細化學奧地利Nfg兩合公司