柿葉多糖及其生物活性的製作方法
2023-04-24 08:47:16
專利名稱：柿葉多糖及其生物活性的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物多糖提取及它的生物活性，更具體地說是柿樹多糖及它的降血糖作用。
諸如肝素之類的多糖在血液系統中具有抗凝血作用是較早被發現的，它已作為藥物應用於臨床。五十年代以後隨著對糖功能認識的深入，逐步發現一定結構的多糖對機體的免疫系統有顯著的作用如抗腫瘤作用，抗病毒作用特別是抗愛滋病作用，抗炎作用和抗輻射作用。這些多糖也已有三種作為藥物在國內外臨床上正式使用(非正式使用的還有數種)。當然還發現某些結構的多糖對消化道系統也有作用如抗嘔吐、抗潰瘍等。所有作為藥物而應用於臨床的多糖最大特點是毒副作用小。另外也有一些多糖具有降血糖活性的報導，但效果不顯著。由於糖尿病已成為一種常見病，嚴重影響患者的生活質量，甚至生命，所以尋找高效低毒的降血糖藥物具有重要的社會意義及應用價值。
柿樹廣泛分布在我國河南等北方省份其果實、柿子是家喻戶曉的，而其樹葉大多作為燃料白白浪費掉，本發明從柿葉中提取多糖並進行各種藥理試驗表明它具有顯著的降血糖作用和免疫促進作用。
本發明目的是提供一種從植物中提取有效成份對降血糖具有明顯作用的具副作用小的多糖藥物或保健品。
本發明是這樣實施的新鮮的或乾燥的柿樹葉子在乙醇中浸泡72小時以上，取出風乾，稱取乾燥後的柿葉，加10-15倍(w/w)去離子水加熱於沸騰情況下3-8小時，過瀘殘渣，再用8-10倍(w/w)去離子水如上法再提取一次，合併二次瀘液，減壓濃縮至原體積的1/15-/20，加入3-5倍乙醇攪拌沉澱，沉澱物經離心，真空乾燥，得到多糖的粗製品，該粗製品即可作為保健品而應用。粗製品經水溶解後，對水透析2天，未透過液減壓濃縮至原體積的1/10加入3倍乙醇沉澱，取沉澱物溶於水中通過DEAE-纖維素柱、水及0.2M NaCl分步洗脫，流出液經硫酸苯酚法檢測，取陽性部份，合併透析，冷凍乾燥，冷凍乾燥物溶於水中，上樣於Sephacrgl S-300凝膠柱，0.1M NaCl展層，示差檢測儀檢測，合併主峰部分，透析，冷凍乾燥。該樣品經HPLC檢測，結果為一單一對稱峰，證明該多糖為純品(即均一部分)，該純品可作為藥物而應用。
採用多糖分離方法，我們在國內首先從柿葉中獲得多糖的粗製品(作保健應用)及純品(作藥物應用)。該多糖不但具有免疫促進作用，更重要的是具顯著的降血糖活性，粗品可作為糖尿病患者的保健品，其純品即可作為糖尿病患者的治療藥品。
在生物活性試驗中，將PTP1B表達純化，得到的酶以GST融合蛋白的形式存在。PTP1B水解底物PNPP的磷脂鍵，得到的產物在410nm處有很強的光吸收。因此可以直接檢測410nm處光吸收的變化以觀察酶的活性變化以及化合物對其的抑制情況(Zhang，ZY.，Dixon，JE.(1994)Adv.Enzymol.681-36)。標準測活體系如下10mM Tris.Cl，pH 7.6，10mM PNPP，2％DMSO，200nM PTP1B。結果分別在濃度為100μg/m(粗品)及10μg/m(純品)對蛋白質酪氨酸磷酸酯酶PTPIB抑制率達95％以上，蛋白質酪氨酸磷酸酯酶PTPIB能夠使磷酸化的胰島素受體發生去磷酸化，從而在體內對胰島素的作用起到調節作用，因此，對II型糖尿病和肥胖具有治療作用。
免疫活性試驗淋巴細胞在有絲分裂原如PHA，ConA，LPS等的刺激下，細胞的形態和代謝可發生一系列的變化，轉化為母細胞，並分化增殖。以MTT法定量測定細胞的增殖。本實驗加入LPS(脂多糖)10μg/ml誘導B淋巴細胞增殖。結果顯示濃度分別為0.01mg/ml(粗品)及0.01mg/ml(純品)其對B淋巴細胞的增殖反應的均屬顯著(P＜0.01)，上述多糖粗品及純品經小鼠LD50試驗其小鼠口服最大耐受量均大於8g/kg，由此結論，粗品及純品不但均具顯著生物活性，而且無毒副作用，可以單獨或者複合作保健品，或進一步作為藥物應用。
本發明的優點1.柿葉來源廣泛，變廢為寶，由原來丟棄或作燃料變為保健品或藥物。
2.提取工藝簡便，成本低廉。
實施例新鮮柿葉在乙醇中浸泡72小時，取出，自然通風乾燥，稱取1Kg乾燥之柿葉，加入10l去離子水，加熱沸騰4小時，過濾得瀘液，瀘渣再加10l去離子水，加熱沸騰4小時過瀘得第二次瀘液，合併二次瀘液，減壓濃縮到800ml，在攪拌下，徐徐加入3倍量90％7醇，獲得沉澱，沉澱物經離心，於真空乾燥箱內(＜60℃)乾燥24小時，取出，粉碎即得到可作保健品應用的多糖28g。
取上述粗製品多糖10g溶於去離子水(100ml)中，對去離子水透析2天，取出透析袋內未透過液，濃縮至100ml上，DEAE-纖維素柱層析，0.2MNaCl洗脫，取流出液糖反應陽性部分，合併，對蒸留水透析二天，未透過液濃縮至10ml上Sephacrgl S-300柱，0.1M NaCl展層，合併有效部位，透析2天減壓濃縮，然後冷凍乾燥，得純品254mg。降血糖試驗取上述粗製品及純品分別溶於水中，使成濃度為100μg/ml及10μg/ml，觀察其對蛋白質酪氨酸磷酸酯的抑制率結果發現其抑制率分別為99％及95％，該實驗所用的磷酸酯PTPIB是從大腸桿菌中表達並純化，實驗中採用陽性參照藥物為2μM的正釩酸鈉。
權利要求
1.一種由柿葉提取的多糖，其特徵在於由柿葉在乙醇中浸泡，然後風乾，加入去離子水，加熱至沸騰3-8小時，過濾、殘渣再用去離子水提取一次，合併濾液，減壓濃縮到小體積，加入3-5倍乙醇攪拌、沉澱，沉澱物離心，再溶於水中對水透析48小時，未透過液減壓濃縮至原體積的1/10，再加入乙醇沉澱，沉澱物溶於水中通過DEAE-纖維素柱，用水及稀NaCl分步洗脫，流處液經硫酸苯酚法檢測，取陽性部分，合併透析液冷凍乾燥。冷凍乾燥物溶於水中，上樣於Sephacrgl凝膠柱，用稀NaCl展層，示差檢測儀檢測，合併主峰部分，透析，冷凍乾燥，樣品HPLC檢測，取單一對稱峰的多糖。
2.根據權利要求1所述由柿葉提取的多糖，其特徵在於沉澱物通過DEAE-纖維素柱用水及0.1-0.3M NaCl分步洗脫。
3.根據權利要求1所述由柿葉提取的多糖，其特徵在於冷凍乾燥物上樣於Sephacrgl凝膠柱，展開劑為0.1-0.3M NaCl溶液。
4.根據權利要求1所述由柿葉提取的多糖，其特徵在於由HPLC檢測樣品取單一對稱峰的多糖。
5.一種柿葉提取的多糖，其特徵在於它對治療II型糖尿病藥物中應用。
6.一種柿葉提取的多糖，其特徵在於它對肥胖病的治療中應用。
全文摘要
本發明提供一種採用由柿葉提取多糖及它的提取方法,該多糖具有免疫促進作用對II糖尿病人具有降糖作用。
文檔編號A61K31/715GK1371920SQ0110548
公開日2002年10月2日 申請日期2001年2月28日 優先權日2001年2月28日
發明者方積年, 陳林祥 申請人:中國科學院上海藥物研究所