一種鹼性普魯蘭酶的製備方法及應用的製作方法

2023-04-23 12:14:11 2

一種鹼性普魯蘭酶的製備方法及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種鹼性普魯蘭酶的製備方法及應用。本發明以好熱地芽孢桿菌Geobacillus?kaustophilus?MCCC1A02570的基因組DNA為模板，設計併合成引物，通過PCR擴增普魯蘭酶基因,將該基因克隆入pET-22b表達載體上，在大腸桿菌E.coli?BL21中進行誘導表達，採用Ni-Sepharose親和層析純化得到高純度的重組普魯蘭酶蛋白。該酶的最適溫度為70℃，最適pH為8.0，在鹼性條件下具有較高的活性和良好的耐熱性。該酶的最適底物為普魯蘭糖，並且其水解支鏈澱粉和糯米澱粉的能力明顯高於直鏈澱粉，顯示其具有較好的水解支鏈的能力。該酶在生產高麥芽糖漿和高葡萄糖漿以及在洗滌劑工業中有潛在的應用前景。
【專利說明】—種喊性普魯蘭酶的製備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及採用基因工程手段獲得一種鹼性普魯蘭酶及其製備方法，屬於生物工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]澱粉中的葡萄糖殘基主要以α-(1，4)糖苷鍵相連，支鏈澱粉中平均每24~30個葡萄糖單位中就有一個分支，分支處以α-(1，6)糖苷鍵相連，α-(1，6)糖苷鍵約佔支鏈澱粉糖苷鍵總量的4~6%。工業生產常用的穀類澱粉中，支鏈澱粉含量高達70~95%。傳統的澱粉酶僅能水解α-(1，4)糖苷鍵，因此在工業生產中無法實現對支鏈澱粉的高效利用。異澱粉酶能夠水解α-(1，6)糖苷鍵，因此被廣泛用於澱粉酶工業中，然而其不能水解由2~3個葡萄糖殘基構成的短支鏈，仍然無法實現對支鏈澱粉的充分利用。普魯蘭酶不僅能專一性地水解α-(1，6)糖苷鍵，並且還能將最小單位的支鏈分解，因此可最大限度地利用澱粉原料。目前普魯蘭酶已被廣泛地應用於澱粉糖化、生產高葡萄糖漿、生產高麥芽糖漿、生產環糊精等澱粉加工工業。有報導稱鑑於普魯蘭酶具有較強的α-(1，6)糖苷鍵水解能力，有研究人員正在嘗試將普魯蘭酶用於低熱量啤酒的生產和牙菌斑的防治以及用作麵包製作的抗氧化劑。
[0003]到目前為止，全世界用於工業生產的普魯蘭酶主要由丹麥NOVO公司和美國傑能科公司供應，其生產的酸性普魯蘭酶在市場上具有壟斷地位。目前我國的普魯蘭酶還僅限於實驗室研究，工業生產上嚴重依賴進口，定價權掌握在少數外國公司手中，導致國內普魯蘭酶價格昂貴。鹼性普魯蘭酶在鹼性條件下有較穩定的酶活，且耐熱性也比較好，可顯著提高澱粉原料的利用率。另外，鹼性普魯蘭酶還可作為有效添加劑應用於洗滌劑中，從而拓寬了普魯蘭酶在工業生產中的應用。高溫鹼性普魯蘭酶具有廣闊的市場前景，然而其在世界範圍內都尚處於研究階段。
[0004]嗜熱菌是一類生活在高溫環境中的微生物，其產生的高溫酶具有很高的熱穩定性，是獲取高溫鹼性普魯蘭酶的良好來`源。嗜熱微生物最適生長溫度很高，發酵工藝非常困難，因此利用基因工程技術改造菌株成為生產普魯蘭酶的有效手段。好熱地芽孢桿菌(Geobacillus kaustophilus MCCC1A02570)是一株從深海熱液口分離得到的嗜熱細菌，其最適生長溫度為55°C。該菌對極端環境具有較好的適應性，其可在pH2-12、溫度5-78°C、鹽度0-30%的極端環境中生長。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種高溫鹼性普魯蘭酶及其製備方法及產品。
[0006]該酶的最適溫度為70°C，最適pH為8.0，在鹼性條件下具有較高的活性和良好的耐熱性。
[0007]該酶的核苷酸序列如下:(SEQ ID N01)
【權利要求】
1.一種表達普魯蘭酶的核苷酸序列，其特徵在於:其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。
2.一種核苷酸序列，其和權利要求1所述的核苷酸序列互補。
3.—種普魯蘭酶，其特徵在於:其胺基酸序列如SEQ ID N02所示。
4.如權利要求3所述的普魯蘭酶在生產高麥芽糖漿和高葡萄糖漿以及在洗滌劑工業中的應用。
5.如權利要求3所述的普魯蘭酶的製備方法，包括如下步驟: (1)設計併合成擴增鹼性普魯蘭酶基因的引物，其序列如下:
上遊引物 2570F:5』 -CTATCATATGCTTCACATCAGCCGA-3』
下遊引物 2570R:5』 -GTTACTCGAGCCCTGCAGGATGG-3』 (2)PCR擴增及重組質粒的構建: 用2570F和2570R引物，以好熱地芽抱桿菌(Geobacillus kaustophilusMCCC1A02570)的基因組DNA為模板進行擴增；PCR產物經限制性內切酶NdeI和XhoI酶切後被連接到經同樣限制性內切酶酶切的表達載體pET-22b上，將連接產物轉化大腸桿菌E.coli DH5ci，篩選含有普魯蘭酶基因的重組質粒，並進行雙酶切和測序驗證； (3)普魯蘭酶的表達與純化 將含有普魯蘭酶基因的重組質粒轉化入大腸桿菌E.coli BL21，用IPTG誘導普魯蘭酶蛋白表達，之後蛋白純化得到普魯蘭酶。
6.如權利要求5所述的普魯蘭酶的製備方法，其特徵在於，步驟(2)PCR擴增條件如下:95°C預變性 5min ；98°C 10s，`55。。30s, 72°C 140s，30 個循環。
7.如權利要求5所述的普魯蘭酶的製備方法，其特徵在於，純化蛋白採用N1-Sepharose 親和層析。
【文檔編號】C11D3/386GK103571862SQ201310250392
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年6月21日 優先權日:2013年6月21日
【發明者】周梅先, 陳逍遙, 阮靈偉 申請人:國家海洋局第三海洋研究所