協同降解石油的複合菌液及其製備方法
2023-05-20 18:57:46 1
專利名稱：協同降解石油的複合菌液及其製備方法
技術領域：
本發明屬於汙染海洋環境生物修復技術領域，具體涉及基於海洋「專性解烴 M" (the obligatehydrocarbonoclastic bacteria, OHCB) ^|1]^Μ ^kMWΨM^n 菌液及其製備方法。
背景技術：
海洋溢油的頻繁發生不僅給海洋養殖業、旅遊業等造成巨大的經濟損失，還會對 海洋生態環境及人類健康造成長遠的負面影響。因此，如何消除海洋溢油汙染、修復受損海 洋生態環境成為海洋環境保護的重要內容之一。生物修復技術由於具有成本低、較徹底、無 二次汙染等優點，逐漸成為處理溢油的一種有效途徑。海洋專性解烴菌是一類溢油發生前在海洋環境中豐度很低甚至低於檢測限， 溢油發生後可以迅速增殖並以石油組分為唯一碳源和能源的微生物。它們當中包括 Alcanivorax (食燒菌屬)、Cycloclasticus (解環菌屬)、Marinobacter (海桿菌屬)、 Marinobacterium(海細菌屬)、Neptunomonas、Oleispira(油螺方寵菌屬)、Thalassolituus 等屬的細菌。20世紀90年代興起的溢油原位生物修復技術，正是通過添加海水中缺乏的 氮、磷元素刺激這類細菌的生長、加快石油降解速率來實現的。由於這類細菌在溢油去除過 程中作用顯著，並且具有迥異於陸源耐鹽降解菌的生長特性、難以獲得純培養，所以它們是 一種重要的、相對稀缺的海洋菌種資源。但是採用單獨一種專性解烴菌往往存在石油降解 速率低、修復效果差的問題。在溢油這種成分極其複雜的有機汙染物降解過程中，在不同降解菌之間存在著各 種複雜的關係，降解菌之間的協同效應是徹底降解溢油汙染物的必然方式。因此，如何充分 利用海洋專性解烴菌之間的協同效應、製備複合菌液對海洋溢油進行生物修復，已成為海 洋溢油生物修復技術研究的難點。
發明內容
本發明的目的是提供一種協同降解石油的複合菌液及其製備方法，即利用微生物 之間在石油降解過程中的協同效應，用3株每洋專性解烴菌製備降解石油的複合菌液，以 高效快速的對海洋岸灘溢油汙染環境進行生物修復。本發明涉及的複合菌液的菌種為2個種、3株海洋專性解烴菌，其中1種(2株)是 食烷菌(Alcanivoraxsp.)，另外1種(1株)是海桿菌(Marinobacter sp.)；上述3株細菌 已分別於2009年8月20日、2010年4月16日保藏至中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號 分別為 CGMCC No. 3735 (菌株Alcanivorax sp. 97C0-5)、CGMCC No. 3736 (菌株Alcanivorax sp. 97C0-6)、CGMCC No. 3244 (菌株 Marinobacter sp. PY97S)，其純培養的主要特徵如下(1)菌株PY97S能夠降解包括萘、2-甲基萘、2，-二甲基萘、聯苯、苊、芴、菲、蒽、二 苯並呋喃、二苯並噻吩、苯並[α ]芘在內的至少11種PAHs。採用GC-MS測定了菌株PY97S 對典型PAHs菲的降解率，發現它對初始濃度為0. 2g/L的菲在IOd後的降解率可達到99%。
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(2)菌株97C0-5、97C0_6均能夠以原油或柴油為唯一碳源和能源生長，並且都能 夠將含有原油的培養基的表面張力從58mN/m降低至28 30mN/m，說明這些菌株可以產生 生物表面活性劑以提高傳質速率，加快石油降解過程。本發明的技術方案為1、協同降解石油的複合菌液(1)本發明的複合菌液是由食烷菌97C0-5、食烷菌97C0-6和海桿菌PY97S的發酵 培養液組成將對數生長後期(0D·分別為0. 5 1. 5，細胞密度為IO8 109CFU/mL)的3 株海洋專性解烴菌(97C0-5、97C0-6、PY97S)的發酵培養液均勻混合製成複合菌液；(2)本發明的複合菌液中3株菌的細胞濃度均為IO7 109CFU/mL。2、食烷菌97C0-5、食烷菌97C0-6和海桿菌PY97S的發酵培養液製備步驟如下(1)製備種子液將超低溫(-80°C )保藏的菌種分別接入50mL IOL的M8培養 基或乙酸鈉培養基，在18 35°C、50 200rpm、避光的條件下培養至對數生長後期，分別制 備三種種子液；(2)發酵培養液製備將上述的種子液按照 10%的接種量分別接入15L 500L的M8培養基或乙酸鈉培養基，發酵條件為發酵溫度控制在18 35°C、通氣量控制在 0. 10 0. 50m3/h、槳葉攪拌速度控制在50rpm 300rpm、在消泡電極的控制下自動流加消 泡劑進行消泡；培養到各自細胞密度為IO8 109CFU/mL時停止發酵，即製得各發酵培養液； 最後將發酵培養液混合製得複合菌液。3、製得的複合菌液通過大容量低溫離心機進行3 10倍濃縮，將複合菌液或濃縮 液置於4°C保藏。其中，M8培養基每升含 22. 79g NaCl, 11. 18g MgCl2 · 6H20，3. 98g Na2SO4,1. 46g CaCl2 · 2H20,1. 30gTAPS0，0. 72g KCl，0. 27g NH4Cl,89. OOmg Na2HPO4 · 7H20，83. OOmg NaBr， 31. OOmg NaHCO3, 27. OOmgH3BO3, 24. OOmg SrCl2 · 6H20, 2. 60mg NaF, 2. OOmg FeCl2 · 4H20，2g 乙酸鈉，0. 5g蛋白腖，0. 5g酵母提取物，0. 5g馬鈴薯浸出粉，0. 2g葡萄糖，0. 2g蔗糖，0. 05g 蘋果酸鈉，0. 05g檸檬酸三鈉，0. 05g酒石酸鉀鈉，pH7. 8 ；用於菌株97C0-5、97C0_6的培養；乙酸鈉培養基每升含 22. 79g NaCl, 11. 18g MgCl2 · 6H20，3. 98g Na2SO4,1. 46g CaCl2 · 2H20,1. 30gTAPS0，0. 72g KCl，0. 27g NH4Cl,89. OOmg Na2HPO4 · 7H20，83. OOmg NaBr， 31. OOmg NaHCO3, 27. OOmgH3BO3, 24. OOmg SrCl2 · 6H20, 2. 60mg NaF, 2. OOmg FeCl2 · 4H20，2g 乙酸鈉，PH7. 6 ；用於菌株PY97S的培養。本發明的複合菌液適合於較低環境溫度的石油汙染生物降解，並且其降解速率較 快，在2周後即可降解82%初始濃度為10g/L的原油；該複合菌液比單一降解菌菌液具有 更高的石油降解率，對石油中烷烴組分和芳香烴組分(包括高分子量芳香烴)的降解更充 分。
圖1為本發明以重量法測定石油降解率比較示意圖。圖2為本發明以生物降解後石油中的部分烷烴組分的半定量結果比較示意圖(相 對於氘代正二十四烷)。圖3為本發明以生物降解後石油中的部分芳香烴組分的相對含量結果比較示意
4圖(相對於氘代三聯苯)。其中NC，不接種的陰性對照處理；PY97S、97C0-5、97C0_6，分別為單一菌株培養 液；圖2中的nC18 nC31是不同碳鏈長度的正構烷烴；Py，植烷。圖3中的C0-N，萘；C0-P，菲；C0-D，二苯並噻吩；C1-N C4-N，取代基為1 4個 碳原子直鏈烷烴的萘；C1-P-C4-P，取代基為1 4個碳原子直鏈烷烴的菲；Cl-D C3-D，取 代基為1 3個碳原子直鏈烷烴的二苯並噻吩。
具體實施例方式實施例1 協同降解石油的複合菌液的製備步驟(1)製備種子液分別配製M8培養基各IOL用於菌株97C0-5、97C0_6的培養，配 制乙酸鈉培養基IOL用於菌株PY97S的培養。將超低溫保藏的凍存菌種按照2%的接種量 分別接入上述兩種培養基，即菌株97C0-5、97C0-6分別接種到10LM8培養基，菌株PY97S接 種到IOL乙酸鈉培養基，在25°C、150rpm、避光的條件下培養至對數生長後期，製備種子液。(2)菌液發酵培養分別配製M8培養基各200L用於菌株97C0-5、97C0_6的發酵罐培養，配製乙酸 鈉培養基200L用於菌株PY97S的發酵罐培養；將種子液按照5%的接種量分別接入M8培 養基或乙酸鈉培養基，即菌株97C0-5、97C0-6的種子液分別接種到200L M8培養基，菌株 PY97S的種子液接種到200L乙酸鈉培養基。其發酵條件為通氣量0. 25m3/h，槳葉攪拌速度 150rpm,發酵溫度25°C。在消泡電極的控制下採取流加豆油的常規方式消泡，提高菌體發酵 產率，停止發酵時細胞密度為IO8 109CFU/mL。(3)將下罐後的3株海洋專性解烴菌的培養液均勻混合，以製備約600L石油降 解複合菌液；複合菌液中食烷菌97C0-5，食烷菌97C0-6，海桿菌PY97S的細胞密度各自為 IO7 109CFU/mL。用大容量4°C低溫離心機在8000rpm、15min的條件下離心以製備5倍濃 縮的石油降解複合菌液製劑濃縮液，便於運輸和使用。(4)將上述複合菌液濃縮液置於4°C保藏。實施例2本發明降解石油效果的檢驗方法為(1)配製石油降解效果檢驗培養基每升含22. 79g NaCl, 11. 18g MgCl2 ·6Η20，3· 98g Na2SO4,1. 46gCaCl2 · 2H20,1. 30g TAPS0，0. 72gKCl，0. 27g NH4Cl, 89. OOmg Na2HPO4 · 7H20, 83. OOmg NaBr, 31. OOmgNaHCO3, 27. OOmg H3BO3, 24. OOmg SrCl2 · 6H20, 2. 60mg NaF，2. OOmg FeCl2 · 4H20, IOg 原油，pH7. 6。(2)石油降解實驗將單一降解菌PY97S、97C0-5、97C0_6的菌液及複合菌液均按 照2%的比例分別接到IOOmL石油培養基中；不接種微生物的處理作為陰性對照；上述每種 處理設3個重複。在150rpm、20°C、避光的條件下培養2周。採用重量法及GC-MS分析、比 較單一降解菌培養液和複合菌液對原油的降解率及石油降解後產物的多元色譜圖。(3)樣品前處理將降解後的石油樣品及陰性對照在IOOOOrpm的條件下離心 IOmin去除細菌細胞，準確量取50mL 二氯甲烷萃取其中的殘餘油汙。從二氯甲烷相準確量 取2mL溶液，先用無水Na2SO4脫水，再用0. 22 μ m耐有機溶劑濾膜過濾，經氮氣吹乾後以正 己烷重新溶解，並添加相應內標(氘代正二十四烷為正構烷烴的內標，氘代三聯苯為多環
5芳烴的內標)，移入GC樣品瓶中並定容至lmL，用於GC-MS對石油降解後殘留的烷烴、芳香 烴組分進行分析測定。另外從二氯甲烷相吸取20mL溶液，用於重量法計算降解率。(4)重量法測定石油降解率將萃取液轉移到尖底燒瓶中，在40°C的條件下旋轉 蒸發，稱量帶有殘留油汙的燒瓶總重，減去燒瓶本身重量，得到殘留油汙的重量m，按照以下 公式計算求得降解率[ (m0-2. 5m)/mj X 100% (m0為最初加入培養基中的石油重量)(5)石油組分的GC-MS分析氣相色譜(Agilent HP7890 Plus)；質譜檢測器 (Agilent HP5975)；色譜柱為 HP_5MS(30mX0. 25_X0. 25 μ m)毛細管柱；進樣口 溫度 2800C ；離子源溫度250°C。載氣為氦氣(99. 999% )，流速lmL/min。程序升溫50°C保持 2min，以6°C /min升至300°C，300°C保持IOmin0掃描模式SCAN、SIM模式；掃描質量範圍 50 500。進樣HP7683自動進樣器，不分流進樣lyL。數據採集和處理HP3365化學工 作站。本發明的實驗結果如下1、複合菌液比單一降解菌菌液具有更高的石油降解率採用重量法測定了生物降 解後培養基中殘留石油的重量，並計算降解率。如圖1所示，複合菌液的處理相對於降解 菌97C0-5菌液、97C0-6菌液的處理具有更高的降解率，它們對石油的降解率分別為82%、 53% 和 47%。2、複合菌液通過降解菌之間的協同效應使石油中烷烴組分充分降解如圖2所 示，經過2周的搖床培養，海桿菌PY97S對烷烴組分的降解作用不顯著，食烷菌97C0-5、 97C0-6對烷烴組分具有較好的降解效果，而加入複合菌液的處理對石油烷烴的降解最徹 底，表現出明顯的協同降解效應。從烷烴色譜峰的半定量結果來看，複合菌液對石油中 Cll C35的烷烴組分的降解是最徹底的。3、複合菌液通過降解菌之間的協同效應使石油中芳香烴組分(包括高分子量芳 香烴)充分降解如圖3所示，經過2周的搖床培養，海桿菌PY97S對出峰時間較早的低分 子量芳香烴組分的降解效果比較顯著，但是對出峰時間較晚的高分子量芳香烴組分的降解 作用不太顯著；食烷菌97C0-5、97C0-6對高、低分子量的烷基化芳香烴組分均具有較好的 降解效果；而加入複合菌液的處理對石油芳香烴的降解效果最好，顯然有特別明顯的協同 降解效應。從石油中芳香烴組分的相對豐度變化來看，複合菌液對石油中芳香烴的降解是 很佳的。綜上所述，本發明的協同降解石油的複合菌液特別用於對海洋溢油汙染的海岸線 或灘涂地帶進行生物修復。
權利要求
一種協同降解石油的複合菌液，其特徵在於該複合菌液由食烷菌97CO 5、食烷菌97CO 6和海桿菌PY97S的發酵培養液組成。
2.如權利要求1所述的協同降解石油的複合菌液，其特徵在於該複合菌液中食烷菌 97C0-5、食烷菌97C0-6和海桿菌PY97S的細胞濃度均為IO7 109CFU/mL。
3.如權利要求1所述的協同降解石油的複合菌液，其特徵在於上述複合菌液用離心機 在8000rpm、15min離心製得5倍濃縮液後於4°C保藏。
4.權利要求1所述的協同降解石油的複合菌液的製備方法，其特徵在於將超低溫保 藏的97C0-5菌種和97C0-6菌種按2%的接種量分別接種到M8培養基，將超低溫保藏的 PY97S菌種按2%的接種量接種到乙酸鈉培養基，且均在25°C、150rpm轉速、避光的條件下 培養到對數生長後期製備種子液；再將食烷菌97C0-5、97C0-6的種子液以5%的接種量分 別接入M8培養基，海桿菌PY97S的種子液以5%的接種量接入乙酸鈉培養基，均在25°C、通 氣量0. 25m3/h、槳葉攪拌速度150rpm，流加消泡劑消泡的條件下培養到細胞密度為IO8 109CFU/mL時停止發酵，分別製得發酵培養液；最後將發酵培養液混合製得複合菌液。
5.如權利要求4所述的協同降解石油的複合菌液的製備方法，其特徵在於上述的流加 消泡劑消泡是採取自動流加豆油的方式消泡。
6.權利要求1所述的協同降解石油的複合菌液應用於海洋溢油汙染的海岸線或灘涂 的生物修復。
全文摘要
本發明涉及一種協同降解石油的複合菌液及其製備方法。該複合菌液由兩株食烷菌97CO-5、97CO-6和一株海桿菌PY97S的發酵培養液混合而成，細胞濃度均為107～109CFU/mL。製備方法是將食烷菌和海桿菌的種子液分別以5％的接種量接入M8培養基或乙酸鈉培養基，在25℃、通氣量0.25m3/h、攪拌速度150rpm、流加消泡劑消泡的條件下發酵培養，再將各發酵培養液混合即製得複合菌液，再離心製成5倍濃縮液後於4℃保藏。該複合菌液適合於較低環境溫度的石油汙染生物降解，對石油中烷烴組分和芳香烴組分的降解更充分，比單一降解菌的菌液具有更高的石油降解率，具有明顯的協同降解效應。本發明的複合菌液應用於對海洋溢油汙染的海岸線或灘涂的生物修復。
文檔編號A62D101/20GK101914442SQ20101022346
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月4日 優先權日2010年7月4日
發明者吳亮, 周文俊, 崔志松, 朱生鳳, 李倩, 王東, 王紹良, 王勝, 鄭立, 陳宇, 高偉 申請人:國家海洋局第一海洋研究所;中海石油環保服務(天津)有限公司