含Fc融合蛋白的酵母表達載體及其構建方法
2023-04-28 07:23:51 1
含Fc融合蛋白的酵母表達載體及其構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種含Fc融合蛋白的酵母表達載體及其構建方法，步驟如下：製備Fc基因片段；將所得的Fc基因片段連接到pMD18-T載體中，得連接產物pMD18T-Fc；將所得的pMD18T-Fc和表達載體pPICZαA經EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切，並利用T4DNA連接酶連接，得含Fc融合蛋白的酵母表達載體pPICZαA-Fc。本發明將非Ig蛋白與抗體分子的Fc段融合，可改善其藥物動力學特性，並使某些生物學活性與抗體的生物學效應功能聯結在一起；該載體可直接將具生物活性的蛋白基因構建到該表達載體中高效表達含Fc端的融合蛋白。
【專利說明】含Fe融合蛋白的酵母表達載體及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種酵母表達載體及其構建方法，特別涉及一種含Fe融合蛋白的酵母表達載體及其構建方法。
【背景技術】
[0002]抗體的Fe端負責抗體的效應功能，如激活補體、結合Fe受體、穿越胎盤等。Fe融合蛋白主要是將生物活性蛋白與IgG的絞鏈區及CH2、CH3區結合。含Fe段的抗體融合蛋白將某些蛋白質與抗體Fe段融合主要是為了產生兩種效果:一是增加該蛋白質分子在血液中的半衰期；二是通過該蛋白分子與其配體的相互作用將Fe段的生物學效應引導到特定目標。
[0003]目前常用的表達載體中未含有Fe端融合蛋白的基因，在表達該類蛋白時需要自己構建，現有技術方案製備Fe融合蛋白是將生物活性蛋白的基因與Fe段基因通過重疊PCR連接好後，再構建到表達載體中，比較費時，費力。
【發明內容】
[0004]基於此，針對現有技術表達載體中未含有Fe端融合蛋白的基因,構建含有Fe的表達載體時，費時費力的問題，本發明提供含Fe融合蛋白的酵母表達載體及其構建方法。
[0005]解決上述技術問題的具體技術方案如下:
[0006]一種含Fe融合蛋白的酵母表達載體的構建方法，包括如下步驟:
[0007](I)製備Fe基因片段，所述Fe基因片段的鹼基組成如SEQ ID N0.3所示；
[0008](2)將步驟(1)所得的Fe基因片段連接到pMD18-T載體中，得連接產物pMD18T-Fc ；
[0009](3)構建表達載體:將步驟(2)所得的連接產物pMD18T_Fc和表達載體pPICZ a A經EcoR 1、Not I雙酶切，並利用T4DNA連接酶連接，得含Fe融合蛋白的酵母表達載體pPICZa A-Fc。
[0010]在其中一些實施例中，步驟(1)所述製備Fe基因片段的製備方法為:以人IgGl的重鏈恆定區為模板，用引物擴增，得Fe基因片段。
[0011]在其中一些實施例中，所述的引物為:
[0012]上遊引物:GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT，
[0013]下遊引物:GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。
[0014]在其中一些實施例中，步驟(2)所述的連接為:於21_23°C連接0.9-1.lh。
[0015]根據上述構建方法製得一種含Fe融合蛋白的酵母表達載體。
[0016]本發明 一種含Fe融合蛋白的酵母表達載體及其構建方法具有以下優點和有益效果:
[0017]本發明的構建方法，可快速、高效地表達含Fe端的融合蛋白；利用該方法得到的含Fe端融合蛋白的酵母表達載體，是將非Ig蛋白與抗體分子的Fe段融合，即直接將具生物活性的蛋白基因構建到該表達載體，所得到的酵母表達載體，可顯著改善的非Ig蛋白藥物動力學特性，並使某些生物學活性與抗體的生物學效應功能聯結在一起。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為人IgGlFc基因PCR擴增結果示意圖；
[0019]圖2為所製備的載體pPICZ a A-Fc構建示意圖；
[0020]圖3為pPICZ a A-Fc瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施例
[0021]本發明通過將IgG1的絞鏈區及CH2、CH3區即Fe段，構建到酵母表達pPICZ a A中，獲得一種含Fe融合蛋白的酵母表達載體及其構建方法，該構建方法可快速、高效的表達含Fe端的融合蛋白。
[0022]為了能夠更清楚地理解本發明的技術內容，特舉以下實施例結合附圖詳細說明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人,分子克隆:實驗室手冊(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學試劑或者試劑盒，均為市售產品。
[0023]其中，質粒H:暨南大學鄧寧教授惠贈PMD18T-PLCH ；
[0024]所用培養基的配方如下:
[0025]LB培養基:蛋白腖lg，酵母提取物0.5g，NaCllg，溶於IOOmL去離子水中，高壓蒸氣滅菌。
[0026]含Amp的LB瓊脂平板培養基:蛋白腖lg，酵母提取物0.5g，NaCllg, 1.5g瓊脂條溶於IOOmL去離子水中，高壓蒸氣滅菌，滅菌完成後待溫度降為50°C是加入Amp，使終濃度為 50 μ g/mL0
[0027]含Zeocin的LB固體平板培養基:蛋白腖lg，酵母提取物0.5g,NaCllg, 1.5g瓊脂條溶於IOOmL去離子水中，高壓蒸氣滅菌，滅菌完成後待溫度降為50°C是加入Zeocin，使終濃度為25 μ g/mL。
[0028]以下將結合具體實施例進一步闡述本發明。
[0029]實施例1
[0030]一種含Fe融合蛋白的酵母表達載體的構建方法，包括如下步驟:
[0031]1、製備Fe基因片段:
[0032]以人IgG1的重鏈恆定區為模板，用引物擴增，得Fe基因片段；
[0033]其中，所述的引物為:
[0034]SEQ ID N0.1
[0035]上遊引物:GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT，
[0036]SEQ ID N0.2
[0037]下遊引物:GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。
[0038](PCR擴增結果參見圖1，其中M為DNA Marker; I為Fe基因片段)
[0039] 其中，Fe基因片段的序列為:[0040]SEQ ID N0.3
[0041]
【權利要求】
1.一種含Fe融合蛋白的酵母表達載體的構建方法，其特徵在於，包括如下步驟: (1)製備Fe基因片段，所述Fe 基因片段的鹼基組成如SEQID N0.3所示； (2)將步驟(1)所得的Fe基因片段連接到pMD18-T載體中，得連接產物pMD18T_Fc； (3)構建表達載體:將步驟(2)所得的連接產物pMD18T-Fc和表達載體pPICZaA經EcoR 1、Not I雙酶切，並利用T4DNA連接酶連接，得含Fe融合蛋白的酵母表達載體pPICZa A-Fc0
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特徵在於，步驟(1)所述的製備Fe基因片段的製備方法為=WAIgG1的重鏈恆定區為模板，用引物擴增，得Fe基因片段。
3.根據權利要求2所述的構建方法，其特徵在於，所述的引物為:
上遊引 物:GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT， 下遊引物:GCGGCCGCTCAITTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。
4.根據權利要求1所述的構建方法，其特徵在於，步驟(2)所述的連接為:於21-23°C連接 0.9-1.1h0
5.根據權利要求1-4任一項所述的構建方法製得一種含Fe融合蛋白的酵母表達載體。
【文檔編號】C12N15/81GK103898154SQ201210584662
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月28日 優先權日:2012年12月28日
【發明者】萬曉春, 呂衛東, 王蒲, 向軍儉 申請人:深圳先進技術研究院