用於提高斑貝鏈黴菌黃黴素產量的方法及菌株的製作方法

2023-04-28 06:59:11

專利名稱：用於提高斑貝鏈黴菌黃黴素產量的方法及菌株的製作方法
技術領域：
本發明屬於工業微生物分子育種領域，具體涉及大腸桿菌-斑貝鏈黴菌接合轉移系統的優 化，高產斑貝鏈黴菌菌株的選育，中間載體的構建和利用篩選得到的斑貝鏈黴菌菌株提高黃 黴素產量的方法。本發明利用基因工程手段破壞一個基因來達到提高斑貝鏈黴菌產生黃黴素
水平的方法，該基因為基因的同源基因，wW基因在天藍色鏈黴菌(&^pto;n_ycM coe"co/or)和阿維鏈黴菌(&^ptom_yces averw/rifc)中是一個抗生素產生的負調節基因。本 發明建立在斑貝鏈黴菌中將"^i4同源基因破壞，利用改造的菌株提高黃黴素的產量。
背景技術：
鏈黴菌屬於一類極具商業價值的工業微生物。自然界中有近70%的抗生素是由鏈黴菌及 其近緣放線菌產生的，它們分別在抗腫瘤、抗真菌、抗細菌、抗寄生蟲等方面具有功效。例 如用於抗家畜寄生蟲和殺蟎蟲的阿維菌素，防治水稻紋枯病的井崗黴素，用於醫療和和獸藥 的紅黴素、泰樂菌素、金黴素，用於動物生長促進劑的黃黴素，用於植物保護的春日黴素、 多氧黴素、慶大黴素，用於抗腫瘤的柔毛黴素，用於免疫抑制劑的FK506和雷帕黴素等。
由於鏈黴菌具有如此大的商業價值，人們想出了很多方法來提高鏈黴菌的抗生素產量， 這些方法主要包括兩大類 一類是通過物理化學的方法對鏈黴菌進行誘變，然後在誘變後代 中篩選高產菌株，這類方法具有很大的盲目性，篩選工作量很大；另一類就是通過遺傳學方 法對菌株進行直接的改造，如原生質體融合再生法，基因工程手段來提高抗生素產量。隨著 分子生物學技術的不斷發展，鏈黴菌基因組研究的不斷深入，人們對鏈黴菌基因功能認識在 不斷深化，通過基因工程手段對菌株進行改造已經成為可能。
對鏈黴菌進行遺傳操作，首先要建立方便快捷的操作方法，其中原生質體轉化和大腸杆 菌一鏈黴菌屬間接合轉移是兩種最常用的方法。原生質體轉化法由於步驟複雜，原生質體再 生容易發生突變及再生困難等難題己經逐漸被接合轉移法所代替。接合轉移方法受體鏈黴菌 狀態分為兩種， 一種是孢子熱激法，另一種是菌絲體法。對於接合轉移，受體菌狀態是影響 因素之一，另一種就是接合轉移用的培養基。合適的培養基可以顯著提高接合轉移效率。
通過基因工程手段對鏈黴菌進行改造，提高抗生素的產量，主要是通過改造抗生素產生 的調節基因和關鍵限速酶基因來實現的。這些調節基因，有的是起正調節作用的，有的是起 負調節作用的，有的是多效性的，有的是專一性的。對於正調節基因，可以通過增加基因劑 量的方法實現抗生素的增產；對於負調節基因，則可通過破壞該基因來提高抗生素的產量。
而破壞負調節基因的方法主要是通過基因中斷或置換來實現的。其基本原理是基於染色體的
同源重組，即用作基因置換的質粒上蘀帶有旃個萇'度合'造而且天然方向一致的染色體片段， 片段之間插入能在鏈黴菌中表達的抗性標記(如安普黴素)，同時載體部分也含有在鏈黴菌中 表達的抗性標記(如卡那黴素和硫鏈絲菌素)。基因置換是在抗生素的選擇壓力下，以單拷貝 或低拷貝的形式發生的，因此質粒在受體菌中一般是不複製的。質粒通常採用的形式有幾種， 如只在大腸桿菌中複製的單功能載體，溫敏型質粒或複製及穩定功能有缺陷的質粒。當質粒 轉入受體菌時，可通過單抗或雙抗篩選獲得發生單交換的轉化子，質粒這時通過與染色體上 同源片段之間的重組而整合到染色體上。將上述轉化子在鬆弛條件下生長一代或幾代，可大 大提高二次交換發生的頻率，然後通過影印或者點種在兩種不同抗生素平板上，挑取只對插 入抗性標記敏感的轉化子即可能為發生基因置換的菌株。
"5ti4^^ (negative regulator of S^eptomycas differentiation)是一個首先在天藍色鏈黴菌 中發現的全局性負調控基因，對天藍色鏈黴菌的產孢、形態分化與抗生素的合成均有負調控 作用。後來又相繼在多種鏈黴菌中發現了"^^同源基因的存在。目前文獻中，還沒有利用該 基因來提高斑貝鏈黴菌黃黴素產量的報導。
本發明的工作是黃黴素生產菌株斑貝鏈黴菌ZM2006中進行的。對於黃黴素生物合成基因 簇的研究現在還是空白，但是通過"^^通用引物PCR擴增斑貝鏈黴菌基因組DNA，發現在斑 貝鏈黴菌染色體上存在"Wv4的同源基因。

發明內容
本發明的目的在於通過基因工程手段來提高斑貝鏈黴菌黃黴素產量，該方法是分子生物 學方法的一種，通過破壞斑貝鏈黴菌染色體上的MdL4同源基因，達到提高黃黴素產量的目的。
本發明進一步提供了對斑貝鏈黴菌進行遺傳操作的培養基，通過該培養基可以快速對斑 貝鏈黴菌進行遺傳操作。
本發明提供的提高斑貝鏈黴菌黃黴素產量的方法如圖l所示，首先，通過通用引物P1和P2 從斑貝鏈黴菌基因組DNA中PCR擴增包括似c^同源基因在內的基因片段，得到含有"^i4同源 基因片段的重組載體。第二步，通過保守引物P3和P4從所構建的重組載體中PCR擴增"^i4同 源基因保守區段；對所得到的《 ^同源基因保守區段進行測序、比較，確定斑貝鏈黴菌中"^4 同源基因的存在；構建n^W基因被破壞了的重組載體。在本發明的實施例中構建了一個這樣 的重組載體，S卩pZMOOl。第三步，通過接合轉移將第二步得到的重組載體轉移到斑貝鏈黴菌 ZM2006中。第四步，通過抗性篩選得到"sdL4基因被破壞了的斑貝鏈黴菌菌株。第五步，通過 PCR驗證第四步得到的斑貝鏈黴菌菌株。本發明的實施例得到了四株這樣的斑貝鏈黴菌菌株， 分別是ZM2007-1、 ZM2007-2、 ZM2007-3和ZM2007-4。第六步，對第五步所得的斑貝鏈黴菌 菌株進行發酵分析，得到黃黴素高產菌株ZM2007-2 (學名為Str印to/B!Kces 6a/^e/^i'e/7sis)，
於2007年8月24日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC;地
址北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所；郵政編碼100101)，保藏號為CGMCC No. 2140。對該方法的具體說明請參見本發明的實施例。
本發明的優點是，建立了斑貝鏈黴菌方便快捷的遺傳操作方法，克服了物理化學誘變的 肓目性和工程浩大的篩選丁作，利用破壞一個在鏈黴菌中廣泛存在的負調節基因，提高黃黴 素生產菌株的產量。


附圖l:利用破壞"^L4同源基因提高斑貝鏈黴菌黃黴素產量的流程附圖2:本發明實例中斑貝鏈黴菌"^^同源基因與天藍色鏈黴菌"^i4基因序列同源性比較； 附圖3:本發明實例中"^i4基因破壞後黃黴素產量提高的效果圖。 附圖4:本發明實例中用於斑貝鏈黴菌的中間載體pZM001的物理構建圖譜。
具體實施例方式
實施例利用中斷斑貝鏈黴菌菌株中的;m^基因來提高黃黴素產量 (1)從斑貝鏈黴菌的基因組DNA中PCR克隆包含肌dL4基因的片段
(a)在30mLTSB培養基(如後面所述)中接種斑貝鏈黴菌ZM2006,在37。C培養36hr，收 集菌絲體，抽提基因組DNA; (b)以斑貝鏈黴菌ZM2006的基因組DNA為模板，用生物信息學分 析得到的通用引物P,: GAAGATCTCATGGACGAGCTGGGCAA和P2: GAAGATCTCCTTGATCTCGTCGAGCCG進 行PCR擴增，PCR反應程序為:95'C預變性5min; 95'C變性45秒，58。C復性lmin， 72。C延伸5min， 30循環；72'C延伸5min。瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到4.7kb左右的帶。(c)將(b)得到的4. 7kb 的條帶進行瓊脂糖凝膠回收，與載體pMD18-T (購於TaKaRa公司的AT克隆試劑盒)進行酶連反 應；(d)將(c)得到的酶連產物轉化DH5a感受態細胞，得到質粒pBIBOOl。
在本實例中以下是應用到的一些培養基的組成(包含一些單項的製備方法)； TSB培養基(用於培養斑貝鏈黴菌，液體)
BD胰腖豆湯粉30g，蒸餾水1000mL, 121。C滅菌15min。 斑貝鏈黴菌基因組DNA抽提方法
用TSB培養基培養斑貝鏈黴菌菌絲體，吸取一定量的菌液於1.5mL離心管中，3000rpm 離心15min收集菌體，加入lmL 10.3%蔗糖溶液洗滌菌體兩次後用500 u L溶菌酶溶液重新 懸浮50mg菌絲體，於37'C溫育約30min至細胞成為半透明狀。加入500 u L 2% SDS,混合 振蕩約lmin直到溶液的粘度顯著下降，55'C溫育15min，然後加入1/10體積3M醋酸鈉 (unbuffered)和200 uL中性苯酚/氯仿，混合振蕩均勻後，12000rpm離心5min，小心地吸 取上清液，棄去白色中間層。用中性苯酚/氯仿重複四五次抽提直至看不見(或非常少)中
間層為止，最後加入l倍體積的異丙醇(或2.2倍體積的無水乙醇)，反覆顛倒至絮狀DNA 沉澱出現。用槍頭挑取沉澱塊置於一新離心管中，加入75。/。乙醇洗滌DNA兩次，最後棄去 所有上清液，待乙醇揮發後，溶解於一定量TE緩衝液中。 LB培養基配方
胰蛋白腖10g,酵母抽提物5g， NaC15g，蒸餾水1000mL， pH7.0 LA培養基配方
胰蛋白腖10g，酵母抽提物5g， NaC15g，瓊脂16g，蒸餾水1000mL, pH7.0 大腸桿菌培養方法
在LB培養基中37t:振蕩培養過夜。 大腸桿菌質粒抽提方法-
大腸桿菌在加入合適抗生素的LB培養基中37'C培養過夜，用1.5mL離心管收集菌液， 12000rpm離心30s去上清收集菌體，加入200 u L預冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl， 10mMEDTA，pH8.0)懸浮菌體，振蕩均勻後加入400 u L溶液II (0.2M NaOH, 1% SDS)，快速顛倒10次左右混合均勻(動作要輕柔)，然後再加入300iiL溶液ni (3.0M乙酸 鉀，pH4.8)混合均勻，12000rpm離心5min，吸取上清，用1/4體積苯酚氯仿溶液振蕩抽提， 12000rpm離心5 min後吸取上清，加入1倍體積異丙醇沉澱質粒DNA,離心5min後去上清收 集沉澱物，用70%乙醇洗滌兩次，置工作檯吹乾後加一定量的TE緩衝液或ddH20溶解。 限制性內切酶的酶切反應方法
限制性內切酶酶切反應的體系為質粒DNA 0.5-2 y g, 10X酶切緩衝液2.5uL,限制性 內切酶5單位，雙蒸水加至25ul，總體系為25uL。反應條件為37'C水浴3 5hr。 DNA的瓊脂糖凝膠回收方法
將無石蠟油的PCR反應液或酶切反應液(50 100y L反應體系)在1%的普通瓊脂糖凝膠 上電泳，染色。在長波紫外燈卜迅速切下含有目標DNA片段的瓊脂糖凝膠，並裝入2mL離心 管屮。儘量切掉不含DNA的瓊脂糖凝膠，這樣可簡化操作,提高回收量及DNA片段的質量。 200—400mg瓊脂糖凝膠中加入0.4mL純化樹脂(使用前充分混勻)，7(TC保溫5—10min，每 2min顛倒混勻1次，使瓊脂糖凝膠完全融化。對於高濃度的瓊脂糖凝膠(2.0%)，每200mg 的瓊脂糖凝膠中加入500 y L純化樹脂，加熱時間延長到15min將混和液裝入離心純化柱， 13000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。加入500u L 80%異丙醇(或乙醇)，13000rpm 離心30秒，倒掉收集管中的廢液。重複上步一次，此步驟13000rpm離心2min，務必將異丙 醇(或乙醇)，再離心lmin。將純化柱套入乾淨的1.5mL或2mL離心管中，加入40uL超純 水或TE緩衝液於純化樹脂上，不能粘在管壁上。放置2min後，13000卬m離心30秒。離心
管中的液體即是純化的PCR產物，取4u L電泳檢測。 酶連反應方法
一般採用10pL反應體系T4連接酶1 nL ,連接酶緩衝液l nL ，外源片段與載體按 DNA摩爾含量3:1或外源更多。 大腸杆茵感受態的製備(CaCl2法)及轉化方法
用牙籤接種一JM109菌株(或DH5oc菌株)單菌落於5mLLB中37。C振蕩培養過夜，然 後按50 100: 1轉接於5mL LB中37'C培養至OD60(H).5~0.8左右停止培養。吸取1.0 mL菌 液於1.5mL離心管中,冰中放置10min， 4'C 3500 rpm離心4min，吸取上清，加入500yL預 冷的0.1MCaCl2,溶液懸浮菌體，於冰中繼續放置30min， 3500 rpm離心4min，吸取上清，加 入100uL預冷的0.1MCaCl2懸浮菌體，置冰上48hr內用於轉化。大腸桿菌感受態細胞也可 以長期保存，製備方法同短期使用的感受態細胞，最後一步菌體懸浮釆用15%甘油(V/V) 配製的0.1MCaCl2,於-20'C預凍lhr後轉移至-70'C低溫冷藏。
轉化時每管加入1 u L質粒DNA (酶連產物視具體情況而定)，於冰上放置30min， 42。C 熱激90秒後繼續放置冰上2mm,加入150ii LLB於37匸振蕩培養45min，然後按每平皿100 WL的量塗布於LA平板上。對於用藍白斑篩選重組質粒，事先應在平板中分別塗布9txL和 40uL的IPTG (20%， W/V)禾B X-Gal (2%， W/V)， 37。C避光放置2 3hr待完全吸收後備 用。
(2)包含被破壞了wsrf^基因的重組載體pZM001、 pZM002和pZM003的構建
2.1 ( a )以質粒pBIBOOl DNA為模板，P3: CCCTGGACGGGCCCGCAGAC和P4 : CAGCTCGGCCTCGGAGAAGA為引物進行PCR擴增，PCR反應程序為95。C預變性5min; 95。C變性45 秒，58。C復性lmin， 72。C延伸5min, 30循環;72。C延伸5min。瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到O. 8kb 左右的帶。(b)將(a)得到的0.8kb左右的條帶進行瓊脂糖凝膠回收，與載體pMD18-T (購於 TaKaRa公司的AT克隆試劑盒)進行酶連反應；(c)將(b)得到的酶連產物轉化DH5 a感受態 細胞，得到質粒pBIB002。將pBIB002送生工測序，軟體分析發現與天藍色鏈黴菌/ ^Z4基因序 列高度相似，同源性高達89.2% (見附圖2)。
2. 2(a)plj773用和〃i7 c/[11雙酶切，然後通過瓊脂糖凝膠電泳回收1. 4kb的片段， 作為PCR反應的模板。根據質粒pBIB002測序結果設計兩條引物，P-SaF: CGGTA-
CTGTTC，用PCR的方法擴增。PCR反應程序為95。C預變性5min; 95。C變性45秒，63°C 復性lmin， 72。C延伸2min， 30循環;72。C延伸5min。瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到1. 4kb左
右的帶。將此擴增帶通過瓊脂糖凝膠電泳回收。(b)將pBIBOOl轉化含有質粒plj790的大腸 桿菌BW25113感受態細胞，得到含有pBIBOOl和plj790兩個質粒的BW25113菌株，用 BW25113/pIJ790/pBIB001表示。(c)製作由(b)得到的BW25113/pIJ790/pBIB001的電轉化感 受態細胞，用(a)得到的1.4kb的回收片段通過電轉化的方法導入BW25113/pIJ790/pBIB001 細胞中，用含安普黴素(50ug/mL)的LA平板作為選擇培養基進行篩選，挑取轉化子。(d) 將轉化子抽提質粒，然後轉化大腸桿菌DH5 a ，用含安普黴素(50ug/mL)的LA平板作為選 擇培養基進行篩選，得到轉化子，將轉化子命名為pBIB003。 (e)將由(d)得來的pBIB003 用5^11酶切，回收5. 6kb的片段，與用BamHI酶切的SuperCosl連接，將連接產物轉化大 腸桿菌DH5a感受態細胞，用含安普黴素(50yg/mL)的LA平板作為選擇培養基進行篩選， 得到轉化子，將轉化子命名為pZMOOl， pZMOOl的物理構建圖如圖4所示。 SOB培養基配方
胰蛋白腖20g，酵母抽提物5個，NaC10.5g，蒸餾水定容到1L， 12rC滅菌30rain，用前
加入lMol/L MgS04 20mL。
BW25113/PIJ7卯/pBIB001的電轉化感受態細胞的製作方法
(a) 挑取BW25113/pIJ790/pBIB001大腸桿菌單菌落，接入5mL含25ug/mL氯黴素，100yg/mL 氨苄青黴素的SOB-MgS(UMgS04終濃度20mMolv/L)中，30。C振蕩培養過夜；
(b) 取200y L過夜培養物至10mL新鮮的S0B-MgS04 (含25ug/mL氯黴素，100ug/mL氨苄青 黴素)中，添加100uLlMol/L的阿拉伯糖誘導入-red重組系統，於30。C,振蕩培養3 4hr至0D6,麵等於0. 4 0. 6;
(c) 將培養物轉入Universal瓶中，冰上放置10min (以下步驟細胞溫度要保持在0 4。C);
(d) 3500rpm 4'C離心5min，棄去上清；
(e) 加入10mL預冷的10X甘油，搖勻。3500rpm 4。C離心5min，棄去上清；
(f) 加入5mL預冷的10X甘油，搖勻。3500rpm 4。C離心5min，儘量棄去上清，用殘留液將 細胞打散。
將1.4kb的回收片段電轉化BW25113/PIJ790/pBIB001細胞的方法
(a) 在預冷的0.2cm的電轉化杯中混合50uL電轉化感受態細胞與l 2uL 1.4kb的回收 片段，混勻後立即電擊，電擊條件200 Q， 25uF, 2.5kv;
(b) 立即在電轉化杯中加入lmL預冷的LB,冰上放置lmin，轉入1.5mLEP管中，37。C振 蕩培養lhr;
(c) 將培養的菌體於4000rpm離心4min，去掉900yL上清，將剩餘的菌體沉澱打散，塗
布含有50ug/mL安普黴素的LA平板，37'C培養過夜，得到轉化子。(3) 將重組載體pZM001通過接合轉移的方法導入斑貝鏈黴菌ZM2006中
實驗過程中發現，由於斑貝鏈黴菌生產菌產孢能力不強，已報導的大腸桿菌與斑貝鏈黴 菌的接合轉移方法(凌華雲論文)已不適合斑貝鏈黴菌"^^基因中斷菌株的篩選，通過摸索 確定斑貝鏈黴菌接合轉移方法如下
(d) 將重組載體pZM001轉化含有pUZ8002質粒的大腸桿菌ET12567感受態細胞中，得 至lj含有pZMOOl和pUZ8002兩個質粒的大腸桿菌ET12567菌株，用 ET12567/pUZ8002/pZM001表示。
(e) 接種lmL斑貝鏈黴菌液體培養物於15mLTSB培養基中，37'C培養18hr。
(f) 轉接2mL (b)中得到的斑貝鏈黴菌液體培養物於18mL新鮮TSB培養基中，37'C培 養16hr。同時挑取大腸桿菌ET12567/pUZ8002/pZM001單菌落於5mL LB (含有50y g/mL卡那黴素、25ug/mL氯黴素和50^g/mL安普黴素)中，37'C培養16hr。
(g) 轉接2mL(c)中得到的斑貝鏈黴菌液體培養物於18mL新鮮TSB培養基中，37'C培 養3 4hr。同時挑取大腸桿菌ET12567/pUZ8002/pZM001單菌落於5mL LB (含有50 ug/mL卡那黴素、25yg/mL氯黴素和50ug/mL安普黴素)中，37。C培養3 4hr。
(h) 同時收集斑貝鏈黴菌菌絲體和大腸桿菌培養物，3500rpm離心10min去上清，收集 菌體，用新鮮TSB懸浮菌體。3500rpm再離心10min去上清，用1/10體積的TSB懸浮 菌體。
(i) 對斑貝鏈黴菌菌絲體進行適度的稀釋，選擇合適的稀釋度，與大腸桿菌等體積混 合後塗布於AS- I和MS培養基，於37。C培養18 20hr。
(j)用含有500u g/mL萘啶酮酸和900u g/mL的安普黴素的lmL水溶液均勻覆蓋平板表
面，在超靜工作檯上打開平板蓋子吹30min使平板表面乾燥。 (k)繼續置37'C培養5 7天後可觀測到接合轉移子。
MS培養基(用於大腸桿菌與斑貝鏈黴菌的接合轉移)配方
甘露醇20g,大豆粉20g瓊脂粉20g，自來水1000mL， 115°C， 15min滅菌2次後備用。 AS-I培養基(用於大腸桿菌與斑貝鏈黴菌的接合轉移)配方
可溶性澱粉5g， NaC12.5g， Na2SO410g， Yeast Extract lg，丙氨酸0.2g，精氨酸0.2g, 天冬醯胺0.5g， 20g瓊脂粉，蒸餾水1000mL, pH 7.5
(4) 篩選ws^i4同源基因被破壞了的斑貝鏈黴菌 將得到的含有PMZ001質粒的斑貝鏈黴菌菌株接種到含有25 " §/11^萘啶酮酸的八5- I培養
基上，37'C培養5天待其長出基內菌絲，挖塊接種於30mL含有30ug/mL安普黴素的TSB培養基 中，37'C培養48hr。將培養物超聲波破碎後梯度稀釋，選擇1(T4， l(T5， 10—6這些不同的稀釋
度塗布含有30ug/mL安普黴素的AS-I平板上，置於37'C培養5 7天，待長出菌落後點種到含 有25yg/mL卡那黴素的AS-I平板上，37'C培養5 7天後觀察，選取在含有25 u g/mL卡那黴素 的AS- I平板上沒有生長的菌落，這些具有安普黴素抗性但對卡那黴素敏感的菌落即為nsdA 基因被破壞的斑貝鏈黴菌，將其命名為ZM2007。重新接種到含有30yg/mL安普黴素的TSB培養 基中，37。C培養36 48hr，收集菌絲體備用。
(5) 斑貝鏈黴菌ZM2007的PCR驗證 抽提斑貝鏈黴菌ZM2006和ZM2007的總DNA，用P3和P4進行PCR反應，PCR反應程序為
95。C預變性5min; 95。C變性45秒，58。C復性lmin， 72。C延伸2min， 30循環;72。C延伸5min。 瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果為，ZM2006的總DNA能擴增出800bp的特徵帶；nsdA基因被破壞的 菌株ZM2007的總DNA能擴增出1. 6kb左右的特徵帶。
(6) 用HPLC測定ZM2007-2產生的黃黴素與出發菌株ZM2006的比較 首先接ZM2006和ZM2007-2單菌落於黃黴素種子培養基(澱粉30g，豆餅粉30g，
K2HP04 .3H20 0.2g， pH7.0-7.2，蒸餾水1L, 12rC滅菌30min )，於37。C 180rpm培養48hr，然 後將培養物1.5mL接種到50mL黃黴素發酵培養基(澱粉50g，豆餅粉20g，玉米漿9g， K2HP04.3H2O0.15g， pH 7.0-7.2， CaCO32,0g，蒸餾水1L， 121。C滅菌30min), 37。C培養7天， 得到發酵產物。
稱2g發酵液，加入10mL萃取液(甲醇50%水溶液)，超聲30min， 12000rpm離心5min，取 上清進行HPLC分析。HPLC泵K-501，紫外檢測器K-2501，色譜柱，C18(5Wn, 250mm*4.6mm); 以0.2%甲酸銨溶液(用10。/。磷酸溶液調節pH值至4.9)-乙腈(55: 45)為流動相，流速為每 分鐘0.5mL;檢測波長為258nm。根據HPLC分析得到各組分面積，計算ZM2006和ZM2007-2 的積分面積，中斷菌株ZM2007-2的黃黴素產量與出發菌株ZM2006相比，提高了20%。
權利要求
1. 一種提高斑貝鏈黴菌黃黴素產量的方法，其步驟是(a)建立高效的大腸桿菌-斑貝鏈黴菌接合轉移系統；(b)利用通用引物從斑貝鏈黴菌基因組DNA中擴增nsdA同源基因片段，得到含有nsdA基因片段的重組載體；(c)構建nsdA基因被破壞了的重組載體；(d)通過接合轉移將(c)步驟得到的重組載體轉移到斑貝鏈黴菌中；(e)抗性篩選得到nsdA基因被破壞了的斑貝鏈黴菌菌株；(f)PCR驗證(e)步驟得到的斑貝鏈黴菌菌株；(g)測定(f)步驟得到的斑貝鏈黴菌菌株的產抗生素的能力，得到黃黴素高產的斑貝鏈黴菌菌株。
2. —種斑貝鏈黴菌ZM2007 (5""邵to附yces 6am6e/^en^ ZM2007，保藏在CGMCC ，保藏 編號為CGMCC No.2140)。
3. 權利要求1所述的方法，其中所述大腸桿菌-斑貝鏈黴菌接合轉移系統所用培養基為MS 和AS- I培養基。
4. 權利要求1所述的方法,其中(c)步驟中構建的基因被破壞了的重組載體是pZMOOl。
5. 權利要求2所述的菌株在提高黃黴素產量中的應用。
全文摘要
本發明屬於工業微生物分子育種領域，具體地說屬於利用分子生物學手段提高斑貝鏈黴菌黃黴素產量的方法及其高產菌株的選育。本發明的方法包括建立高效的大腸桿菌-斑貝鏈黴菌屬間接合轉移系統；利用通用引物從斑貝鏈黴菌基因組DNA中將含有nsdA同源基因的片段克隆下來，得到含有nsdA同源基因片段的重組載體；構建nsdA基因被破壞了的重組載體；將此載體轉移到斑貝鏈黴菌中；通過抗性篩選得到nsdA同源基因被破壞的斑貝鏈黴菌菌株；對斑貝鏈黴菌菌株進行黃黴素發酵測定，得到黃黴素高產菌株。所述斑貝鏈黴菌保藏於CGMCC。本發明解決了現有技術存在的缺陷，提供了利用基因工程手段改造斑貝鏈黴菌及提高黃黴素產量的新途徑。
文檔編號C12R1/465GK101381722SQ200710146028
公開日2009年3月11日 申請日期2007年9月7日 優先權日2007年9月7日
發明者張國棟, 芹 曹, 鄭應華, 勇 閔, 鵬 齊 申請人:中牧實業股份有限公司