一種白果內酯的分離純化方法

2023-04-28 21:45:26 3

一種白果內酯的分離純化方法
【專利摘要】本發明公開了一種白果內酯的分離純化方法。本發明方法包括下列步驟：（1）製備銀杏內酯富集物；（2）反相吸附樹脂柱層析製得白果內酯粗品；（3）白果內酯粗品重結晶後得到白果內酯精品。本發明方法製得的白果內酯含量可達98%-99%。本發明方法所使用的填料為MCI-GEL或NM100反相吸附樹脂，具有很好的選擇性，能大大提高白果內酯的分離效率，並可以再生利用，毒性低、使用成本低。本發明溶媒簡單易得，所用設備為常規設備，操作簡便，能耗少，生產安全，無汙染，所得產品純度高，適於工業化生產，有較大的應用價值。
【專利說明】一種白果內酯的分離純化方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及藥物的分離純化方法，具體涉及一種白果內酯的分離純化方法。
【背景技術】
[0002]銀杏葉的成分組成複雜，內含多種活性成分，主要有黃酮、萜內酯，此外還有有機酸、烷基酚和烷基酚酸、留體化合物、微量元素等。而銀杏葉中的藥用成分主要是銀杏黃酮類和銀杏內酯類物質。目前從銀杏葉中主要分離得到二萜內酯和倍半萜內酯，即銀杏內酯A、B、C、J、M和白果內酯。白果內酯屬倍半萜內酯，分子結構中僅含有一個戊烷。白果內酯有很強的生物活性，具有多方面的神經保護作用，包括促進神經生長、改善老年記憶功能、防止老年痴呆的發生等。由於銀杏葉中萜內酯的含量極低，因此，要得到具有高藥用價值的銀杏內酯和白果內酯，則須將銀杏葉或其粗提物進行再提取精製。目前文獻報導的銀杏內酯提取分離方法主要有:溶劑提取法，溶劑提取-色譜柱分離法、超臨界提取分離法、高速逆流色譜法及模擬移動床色譜法等，其中應用最多的是色譜柱分離法，填料多採用矽膠、氧化鋁及反相C18矽膠柱填料等。中國發明專利《從銀杏葉中提取分離銀杏內酯A、B、C、J及白果內酯單體的方法》(專利申請號200710050242.1)和《從銀杏葉中提取分離白果內酯的方法》(專利申請號200710050244.0)中採用矽膠柱層析和正己烷-乙酸乙酯溶劑系統洗脫的方法分離白果內酯。但是，該方法中使用的矽膠不能回收再利用，還要使用大量有機溶劑洗脫，不利於工業化生產。中國發明專利《銀杏內酯A、B、C、J和白果內酯單體的高效分離純化方法》(專利申請號200810046162.3)和《白果內酯的分離純化製備方法》(專利申請號201210457118.8)中分別採用製備型高效液相色譜柱和反相矽膠柱層析製備白果內酯，此方法的缺點在於反相矽膠載樣量小，甲醇或乙腈使用量大，工藝成本較高，不利於大量製備。因而，上述純化精製方法尚存在各種缺陷，不能高效經濟環保地分離出高純度的白果內酯，亟待進一步改進提取分離白果內酯的方法。

【發明內容】

[0003]本發明所要解決的技術問題在於克服上述不足之處，研究設計分離純化簡便、成本低、有利於環保，適用於工業化生產的白果內酯的分離純化方法。
[0004]本發明提供了一種白果內酯的分離純化方法。
[0005]本發明的方法包括以下步驟:
[0006](I)製備銀杏內酯富集物:取銀杏葉提取物(EGB)，有機溶劑萃取，萃取液減壓蒸乾，得到銀杏內酯富集物；
[0007](2)反相吸附樹脂柱層析:銀杏內酯富集物通過反相吸附樹脂，先用0-20%的乙醇洗脫1-4BV除雜，再用20%-50%乙醇洗脫樹脂1-8BV，收集含白果內酯的洗脫液回收溶劑至幹，得到白果內酯粗品；
[0008](3)重結晶:白果內酯粗品用10%_60%乙醇加熱溶解過濾後，2°C -10°C冷藏放置12-48h，析出結晶，反覆結晶1-3次，用純化水洗晶1-5次，於60°C _120°C真空烘乾，即得高純度白果內酯。
[0009]所述BV為本領域公認的洗脫柱體積單位。
[0010]本發明的白果內酯的分離純化方法，所述步驟(1)銀杏葉提取物(EGB)為市售，或通過下列方法製備:以銀杏幹葉為原料，粉碎，用40%-80%乙醇水溶液提取，提取溶劑用量為藥材量的4-8倍W/V，提取次數為3-4次，每次提取時間為1-2小時，合併提取液，減壓濃縮回收乙醇至無乙醇味後，過濾，濾液上大孔吸附樹脂DlOl或HP20柱，柱體積為藥材量的1-1.5倍量W/V，水洗2-3BV去雜，60%-80%乙醇洗脫至洗脫液顏色變淡為止，減壓濃縮洗脫液即得銀杏葉提取物。
[0011]步驟(1)的有機溶劑選自乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酮、甲基乙基酮、正丁醇或異丁醇中的一種或兩種混合溶劑萃取，優選乙酸乙酯或丙酮，萃取次數為1-6次，優選3次，每次萃取所用溶劑用量為銀杏葉提取物5-15倍量W/V，優選10倍量W/V。
[0012]所述步驟(2)將反相吸附樹脂柱層析所得含白果內酯流份於55°C -65 °C和-0.09—0.1MPa條件下減壓旋蒸乾至無溶劑，40°C _70°C加熱溶解於10%_60%乙醇中，趁熱過濾，濾液於2V -10°C條件下放置12-48小時，析出結晶，過濾即得白果內酯粗品。
[0013]步驟(2)所述反相吸附樹脂填料為MC1-GEL CHP系列反相吸附樹脂或匪100系列反相吸附樹脂。
[0014]所述MC1-GEL CHP系列反相吸附樹脂為三菱化學株式會社生產，型號為CHP20/P120,其技術參數為:粒徑為75-150 u m,平均粒徑為120 y m，PH範圍為0-14，孔徑為450埃，基體為聚苯乙烯和二乙烯基共聚物。
[0015]所述匪100系列反相吸附樹脂為蘇州納微科技有限公司生產,型號為匪100,其技術參數為:粒徑為50-150 i`im，孔徑為300埃，基體為聚苯乙烯和二乙烯基苯。
[0016]除雜溶劑為0-20%乙醇溶液，優選10%乙醇溶液，洗脫體積為1-4BV，優選1-2BV ；
[0017]洗脫溶劑為20-50%乙醇，優選30-40%乙醇，洗脫體積為3-10BV，優選6-8BV。
[0018]所述步驟(3)結晶溶劑為10%_60%乙醇；重結晶步驟為反覆重結晶1-3次；洗結晶步驟為用純化水洗結晶1-5次。
[0019]優選結晶溶劑為20%_50%乙醇；重結晶步驟為反覆重結晶2次；洗結晶步驟為用純化水洗結晶3次。
[0020]本發明方法製得的白果內酯通過檢測含量為98%_99%。
[0021]本發明方法與現有技術相比，取得了很好的效果:
[0022]本發明方法所使用的填料為MC1-GEL或WlOO反相吸附樹脂，該填料對銀杏內酯具有很好的選擇性，能大大提高白果內酯的分離效率，並且填料可以再生利用，比矽膠、氧化鋁等柱層析所用的有機溶劑毒性低、使用成本低。
[0023]另外，本發明由於分離純化白果內酯的溶媒簡單易得，所用設備為常規設備，因此操作簡單，能耗少，採用無毒吸附劑吸附，乙醇解吸，故生產安全，無汙染，並且所得產品純度高，適於工業化生產，有較大的應用價值。
【具體實施方式】
[0024]下面通過實施例對本發明做進一步說明，而不是為了限制本發明的範圍。
[0025]實施例1[0026]取銀杏葉提取物(EGB)(市售，銀杏總內酯含量≥6%)4g懸浮於40mL水中，用乙酸乙酯萃取三次，每次50mL，萃取溶液於60°C和-0.09—0.1MPa條件下減壓回收溶劑，萃取物為銀杏內酯富集物，HPLC-ELSD檢測總銀杏內酯含量為34.5%，萃取物60oC加熱溶於IOOmL水中，用IOOmL的MC1-GEL樹脂進行吸附，吸附時間為0.5h，先用10%的乙醇洗脫3BV除雜，再用30%乙醇洗脫樹脂8BV，HPLC檢測後收集含白果內酯洗脫液，於65°C和-0.09—0.1MPa條件下，減壓旋蒸乾至無溶劑得白果內酯粗品，白果內酯粗品加入40%乙醇(2.8mL)，60°C加熱溶解後，放置冰箱(4°C ) 24h，析出結晶，反覆重結晶2次，用純化水(每次ImL)洗晶3次，於65°C真空加熱烘乾，得到白果內酯83mg，HPLC-ELSD檢測含量為98.4%。
[0027]銀杏內酯和白果內酯的檢測方法選用HPLC-ELSD檢測法(參考文獻為醫藥導報，2010 年 3 月，29 (3):377-378)。
[0028]實施例2
[0029]取銀杏葉提取物(EGB)(市售，銀杏總內酯含量≥6%) 4g懸浮於40mL水中，用乙酸乙酯萃取三次，每次50mL，萃取溶液於60oC減壓回收溶劑，萃取物為銀杏內酯富集物，HPLC-ELSD檢測總銀杏內酯含量為31.8%，萃取物60°C加熱溶於IOOmL水中，用IOOmL的匪100樹脂進行吸附，吸附時間為0.5h，先用10%的乙醇洗脫3BV除雜，再用30%乙醇洗脫樹脂8BV，HPLC檢測後收集含白果內酯洗脫液，於65oC和-0.09—0.1MPa條件下，減壓旋蒸乾至無溶劑得白果內酯粗品，回收溶劑，白果內酯粗品加入40%乙醇(2.6mL)，60°C加熱溶解後，放置冰箱(4°C)24h，析出結晶，反覆重結晶2次，用純化水(ImL)洗晶3次，於65°C真空加熱烘乾，得到白果內酯71mg，HPLC-ELSD檢測含量為98.8%。
[0030]實施例3
[0031]取幹銀杏葉(市售)300g，粉碎，80%乙醇回流提取三次，溶劑用量依次為2.4L、1.5L和1.5L，每次提取2h，合併提取液，60°C和-0.09—0.1MPa條件下，減壓濃縮至無乙醇味，過濾，濾液上大孔吸附樹脂DlOl柱，純化水(1000mL)洗柱去雜，70%乙醇(2000mL)洗脫至洗脫液顏色變淡(薄層層析檢測無銀杏葉提取物即可)，洗脫液於60°C和-0.09-0.1MPa條件下，減壓旋蒸乾至無溶劑得銀杏葉提取物(6g)，HPLC-ELSD檢測銀杏總內酯含量為6.5%
[0032]銀杏葉提取物6g用乙酸乙酯萃取三次，每次150mL，萃取溶液於60°C減壓蒸乾回收溶劑，萃取物為銀杏內酯富集物，HPLC-ELSD檢測總銀杏內酯含量為29.3%，萃取物60°C加熱溶解於20mL水中，用70mL的MC1-GEL樹脂進行吸附，吸附時間為lh，先用10%乙醇洗脫3BV除雜，再用30%乙醇洗脫樹脂6BV，HPLC檢測後收集含白果內酯洗脫液，於65°C和-0.09-0.1MPa條件下，減壓旋蒸乾至無溶劑減壓濃縮幹得白果內酯粗品，回收溶劑，白果內酯加入30%乙醇3.8mL，60°C加熱溶解後，放置冰箱(4°C )24h，析出結晶，反覆重結晶3次，用純化水(1.5mL)洗晶3次，於80°C真空加熱烘乾，得到白果內酯102mg，HPLC-ELSD檢測含量為98.5%。
[0033]實施例4
[0034]取幹銀杏葉(市售)500g，粉碎，80%乙醇回流提取三次，溶劑用量依次為4L、2.5L和2.5L，每次提取2h，合併提取液，60°C和-0.09—0.1MPa條件下，減壓濃縮至無乙醇味，過濾，濾液上大孔吸附樹脂DlOl柱，純化水(1500mL)洗柱去雜，70%乙醇(3000mL)洗脫至洗脫液顏色變淡(薄層層析檢測無銀杏葉提取物即可)，洗脫液於60°C和-0.09-0.1MPa條件下，減壓濃縮幹得銀杏葉提取物(7.2g)，HPLC-ELSD檢測銀杏總內酯含量為9.9%。[0035]銀杏葉提取物7.2g用乙酸乙酯萃取三次，每次250mL，萃取溶液於60oC減壓蒸乾回收溶劑，萃取物為銀杏內酯富集物，HPLC-ELSD檢測總銀杏內酯含量為31.8%，萃取物60°C加熱溶解於40mL水中，用IOOmL的NM100樹脂進行吸附，吸附時間為lh，先用10%乙醇洗脫3BV除雜，再用30%乙醇洗脫樹脂6BV，HPLC檢測後收集含白果內酯洗脫液，於65°C和-0.09-0.1MPa條件下，減壓旋蒸乾至無溶劑得白果內酯粗品，回收溶劑，白果內酯加入50%乙醇4.2mL，60°C加熱溶解後，放置冰箱(4°C) 24h，析出結晶，反覆重結晶3次，用純化水(1.5mL)洗晶3次，於80°C真空加熱烘乾，得到白果內酯(153mg，HPLC-ELSD檢測含量為98.4%) o
[0036]實施例5
[0037]按實施例3的方法製備銀杏內酯富集物(1.8g)，HPLC-ELSD檢測總銀杏內酯含量為37.6%，萃取物60oC加熱溶解於20mL水中，用70mL的MC1-GEL樹脂進行吸附，吸附時間為1.5h，先用10%乙醇洗脫4BV除雜，再用25%乙醇洗脫樹脂8BV，HPLC檢測後收集含白果內酯洗脫液，於60°C和-0.09-0.1MPa條件下，減壓旋蒸乾至無溶劑減壓濃縮幹得白果內酯粗品，回收溶劑，白果內酯加入25%乙醇6.8mL，50°C加熱溶解後，放置冰箱(4°C) 36h，析出結晶，反覆重結晶2次，用純化水(1.5mL)洗晶3次，於60°C真空加熱烘乾，得到白果內酯205mg, HPLC-ELSD 檢測含量為 98.Tl。
[0038]實施例6
[0039]按實施例4的方法製備銀杏內酯富集物(3.3g)，HPLC-ELSD檢測總銀杏內酯含量為18.6%，萃取物60oC加熱溶解於40mL水中，用IOOmL的NM100樹脂進行吸附，吸附時間為1.5h，先用10%乙醇洗脫3BV除雜，再用35%乙醇洗脫樹脂6BV，HPLC檢測後收集含白果內酯洗脫液，於55°C和-0.09-0.1MPa條件下，減壓旋蒸乾至無溶劑得白果內酯粗品，回收溶劑，白果內酯加入45%乙醇6.2mL，60 V加熱溶解後，放置冰箱(4°C ) 24h，析出結晶，反覆重結晶3次，用純化水(1.5mL)洗晶3次，於70°C真空加熱烘乾，得到白果內酯(241mg，HPLC-ELSD 檢測含量為 98.8%)。
【權利要求】
1.一種白果內酯的分離純化方法，其特徵在於，該方法包括下列步驟: (1)製備銀杏內酯富集物:取銀杏葉提取物，有機溶劑萃取，減壓蒸乾即得銀杏內酯富集物； (2)反相吸附樹脂柱層析:銀杏內酯富集物通過反相吸附樹脂，先用0-20%的乙醇洗脫1-4BV除雜，再用20%-50%乙醇洗脫樹脂1-8BV，收集含白果內酯的洗脫液回收溶劑至幹，得到白果內酯粗品； (3)重結晶:白果內酯粗品用10%-60%乙醇加熱溶解過濾後，2°C-10°C冷藏放置12-48h，析出結晶，反覆結晶1-3次，用純化水洗晶1-5次，於60°C _120°C真空烘乾，即得高純度白果內酯。
2.根據權利要求1所述的一種白果內酯的分離純化方法，其特徵在於，所述步驟(1)銀杏葉提取物為市售，或通過下列方法製備:以銀杏幹葉為原料，粉碎，用40%-80%乙醇水溶液提取，提取溶劑用量為藥材量的4-8倍W/V，提取次數為3-4次，每次提取時間為1-2小時，合併提取液，減壓濃縮回收乙醇至無乙醇味後，過濾，濾液上大孔吸附樹脂DlOl或HP20柱，柱體積為藥材量的1-1.5倍量W/V，水洗2-3BV去雜，60%-80%乙醇洗脫至洗脫液顏色變淡為止，減壓濃縮洗脫液即得銀杏葉提取物。
3.根據權利要求1所述的一種白果內酯的分離純化方法，其特徵在於，所述步驟(1)有機溶劑選自乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酮、甲基乙基酮、正丁醇或異丁醇中的一種或兩種混合溶劑萃取，優選乙酸乙酯或丙酮，萃取次數為1-6次，優選3次，每次萃取所用溶劑用量為銀杏葉提取物5-15倍量W/V，優選10倍量W/V。
4.根據權利要求1所述的一種白果內酯的分離純化方法，其特徵在於，所述步驟(2)反相吸附樹脂填料為MC1-GEL CHP系列反相吸附樹脂或WlOO系列反相吸附樹脂。
5.根據權利要求4所述的一種白果內酯的分離純化方法，其特徵在於，所述步驟(2)MC1-GEL CHP系列反相吸附樹脂為三菱化學株式會社生產，型號為CHP20/P120，其技術參數為:粒徑為75-150 u m,平均粒徑為120 y m，PH範圍為0-14，孔徑為450埃，基體為聚苯乙烯和二乙烯基共聚物；所述匪100系列反相吸附樹脂為蘇州納微科技有限公司生產，型號為匪100，其技術參數為:粒徑為50-150 iim，孔徑為300埃，基體為聚苯乙烯和二乙烯基苯。
6.根據權利要求1所述的一種白果內酯的分離純化方法，其特徵在於，所述步驟(2)除雜溶劑為0-20%乙醇溶液，優選10%乙醇溶液，洗脫體積為1-4BV，優選1-2BV ;洗脫溶劑為20%-50%乙醇，優選30%-40%乙醇，洗脫體積為3-10BV，優選6-8BV。
7.根據權利要求1所述的一種白果內酯的分離純化方法，其特徵在於，所述步驟(2)將反相吸附樹脂柱層析所得含白果內酯流份於55oC-65oC和-0.09—0.1MPa條件下減壓旋蒸乾至無溶劑，40°C -70°C加熱溶解於10%-60%乙醇中，趁熱過濾，濾液於2V _10°C條件下放置12-48小時，析出結晶，過濾即得白果內酯粗品。
8.根據權利要求1所述一種白果內酯的分離純化方法，其特徵在於，所述步驟(3)結晶的溶劑為10%-60%乙醇；重結晶為反覆重結晶1-3次；用純化水洗結晶1-5次。
9.根據權利要求8所述一種白果內酯的分離純化方法，其特徵在於，所述步驟(3)結晶溶劑為20%-50%乙醇；重結晶為反覆重結晶2次；用純化水洗結晶3次。
10.根據權利要求1所述的一種白果內酯的分離純化方法，其特徵在於，步驟(3)重結晶後得到的白果內酯含量為98%-99%。
【文檔編號】C07D493/20GK103524526SQ201310482318
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月15日 優先權日:2013年10月15日
【發明者】肖志勇, 於垂亮, 呂署一, 徐繼紅, 梅錦平 申請人:上海信誼百路達藥業有限公司