一種基於液體深層發酵的樟芝無性孢子的製備方法及應用的製作方法
2023-04-26 00:35:46
專利名稱：一種基於液體深層發酵的樟芝無性孢子的製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術領域，具體涉及一種基於液體深層發酵的樟芝無性孢子的製備方法及應用。
背景技術：
樟芝(Antrodia camphorata)，俗名牛樟芝、牛樟菇，是臺灣特有的一種藥用真菌 (多孔菌科，非褶菌目)，具有高度的寄主專一性，只腐生於臺灣特有的常綠闊葉喬木牛樟樹的芯材內部。長期以來，樟芝被民間用於解酒保肝、治療肝痛、食物中毒、腹痛、腹瀉、炎症、皮膚瘙癢和肝癌等病症，具有良好療效。現代藥理研究證實樟芝子實體及發酵產物在保肝、抗氧化、治療肝癌方面具有獨特的功效。迄今為止，從樟芝的子實體和發酵產物中已經分離得到70多種化合物，包括多糖、二萜類、三萜類、留體類、苯環衍生物等，由於樟芝良好的藥用功能和野生數量稀少且生長十分緩慢，使得其市場價格極高，被稱為世界上最昂貴的藥用真菌。目前研究學者和開發商都非常關注樟芝人工培養技術的研究。人工培養樟芝的技術主要有兩種途徑一是人工栽培子實體。這固然是最理想的方法，但樟芝固體栽培時間長達數月之久，難以商業化生產；二是利用無性型菌株進行菌絲體發酵，再從發酵產物中提取功能組分。這是目前較為現實，最經濟環保的一條樟芝開發途徑。多家研究單位已對樟芝深層培養技術進行了研究。從研究結果來看，現有的樟芝深層培養技術主要存在下述問題 1)與其它微生物相比，樟芝的發酵周期較長。樟芝菌絲體發酵階段的時間大多需要十餘天， 若加上菌種活化、發酵種子製備的時間則更久；幻發酵種子的質量不穩定容易導致樟芝發酵過程的可控性較差。傳統樟芝發酵均採用斜面菌絲挖塊法進行接種，該法容易造成接種不均勻，種子批次質量不穩定等問題。另外，樟芝絲狀菌絲在發酵過程中易纏繞形成菌絲球，普遍存在菌球內外傳質、傳熱、溶氧不一的情況。因此，整個樟芝發酵過程可控性較差， 最終導致樟芝發酵產物質量的不穩定；3)因為樟芝發酵時間長，當發酵完成出罐後再進行清洗、空消、配置培養基、實消、冷卻以後再接種，非生產的清理時間佔用過長，影響生產效率。同時由於生產周期長，工藝環節多，導致發酵過程中容易發生汙染，對發酵設備要求較高，因此生產成本高，也影響發酵產物的質量。已有研究發現，野生樟芝在其生長周期內可以產生三種無性繁殖體，包括菌絲體、 節孢子和厚垣孢子。樟芝節孢子和厚垣孢子均為無性孢子。目前未見在深層液體發酵過程中樟芝大量產生無性孢子的報導。
發明內容
本發明的目的，是提供一種通過液體深層發酵大量生產樟芝無性孢子的方法及所產無性孢子的應用。本發明的目的通過以下方案實現1.將樟芝菌絲體轉接至斜面培養基中，25_32°C培養168-312小時。
斜面培養基(g/L)馬鈴薯150-200，葡萄糖10-20，瓊脂15-25，pH自然。2.將步驟1中的斜面菌種轉接入裝有搖瓶培養基的搖瓶中，26-30°C培養，轉速 100-180rpm,培養 48-72 小時。搖瓶培養基(g/L)葡萄糖20-30，蛋白腖2-4，硫酸鎂0.5-1，磷酸二氫鉀1_2，麩皮 2-4，pH 4. 5。3.將步驟2中的樟芝發酵液按10% -20%的接種量轉接入裝有種子培養基的種子罐中，26-30°C培養，轉速50-150rpm，通氣量0. 5_2vvm，培養48-72小時。種子罐培養基與搖瓶培養基相同。4.將步驟3中的樟芝發酵液按10 % -20 %的接種量轉接入裝有發酵培養基的發酵罐中，26-30°C培養，轉速50-150rpm，通氣量0. 5_2vvm，培養120-192小時。顯微鏡檢驗樟芝發酵液中可觀察大量的無性孢子存在。發酵培養基(g/L)葡萄糖20-40，蛋白腖2-4，硫酸鎂0.5-2，磷酸二氫鉀1_4， ρΗ4· 5。本發明的有益效果是採用本發明的深層液無性孢子的快速發酵工藝可，使樟芝發酵周期較原有分批發酵工藝至少能夠縮短40%，發酵產物質量提高，雜菌汙染機會減少， 成本降低。顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容再做進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。
圖1深層發酵過程產生的樟芝無性孢子(放大400倍)圖2不同接種方法對樟芝生長的影響
具體實施例方式實施例1採用搖瓶發酵製備樟芝無性孢子1.菌種以樟芝(Antrodia camphorata)保藏號為ATCC No. 200183的菌株作為出發菌種。2.斜面培養將樟芝菌絲體轉接至斜面培養基中，28°C培養觀8小時。斜面培養基(g/L):馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，pH自然。3.種子搖瓶培養斜面菌種轉接入裝有IOOmL搖瓶培養基的500mL搖瓶中， 培養，轉速lOOrpm，培養72小時。搖瓶培養基(g/L)葡萄糖20，蛋白腖2，硫酸鎂0.75，磷酸二氫鉀1.5，麩皮2，？!1 4. 5。4.發酵搖瓶培養樟芝發酵液按15%的接種量轉接入裝有IOOmL發酵培養基的 500mL發酵搖瓶中，28°C培養，轉速lOOrpm，培養240小時。
發酵培養基(g/L)葡萄糖25，蛋白腖2，硫酸鎂1，磷酸二氫鉀2，pH 4. 5。發酵完成後，顯微鏡檢驗樟芝發酵液中可觀察到大量的無性孢子存在(見圖1)， 濃度為3X107個/mL。將發酵液用6層紗布過濾獲得菌球和菌絲，濾出液進行離心(8000 轉/分，20min)獲得無性孢子。實施例2採用發酵罐發酵製備樟芝無性孢子1.菌種以樟芝(Antrodia camphorata)保藏號為BCRC No. 35398的菌株作為出發菌種。2.斜面培養將樟芝菌絲體轉接至斜面培養基中，26°C培養312小時。斜面培養基(g/L)馬鈴薯180，葡萄糖18，瓊脂18，pH自然。3.種子搖瓶培養將樟芝斜面菌種轉接入裝有IOOmL搖瓶培養基的500mL搖瓶中，26°C培養，轉速lOOrpm，培養48小時。搖瓶培養基(g/L)葡萄糖20，蛋白腖2，硫酸鎂0. 5，磷酸二氫鉀1，麩皮2，？朋.5。4.種子罐發酵將樟芝發酵液按15%的接種量轉接入裝有種子培養基的種子罐中，26°C培養，轉速150rpm，通氣量lvvm，培養48小時。種子罐培養基與搖瓶培養基相同。5.發酵罐發酵樟芝發酵液按15%的接種量轉接入裝有發酵培養基的發酵罐中， 培養，轉速lOOrpm，通氣量lvvm，培養MO小時。發酵培養基(g/L)葡萄糖30，蛋白腖2，硫酸鎂1，磷酸二氫鉀2，pH 4. 5。顯微鏡檢驗樟芝發酵液中可觀察大量的無性孢子存在，濃度為IXlO8個/mL。將發酵液用板框過濾機進行過濾獲得菌球和菌絲，濾出液進行離心(8000轉/分，20min)獲得無性孢子。實施例3採用無性孢子作為接種物的樟芝發酵方法將按照實施例1或實施例2中所述方法製備的樟芝無性孢子作為發酵種子。將無性孢子以IX IO5個/mL的濃度直接接入發酵培養基，孢子在Mh內即可萌發完畢形成菌絲體，並開始進入生長對數期進行生長(圖幻，發酵8天後生物量可達最高。而採用傳統的斜面菌絲挖塊接種法進行樟芝發酵則需要4-5d才進入生長對數期(圖幻，種子液轉接入發酵培養基中需要12-14天才能發酵完成獲得發酵產物。因此，採用無性孢子作為深層液體發酵的接種源，能夠縮短樟芝的發酵周期。另外，孢子便於計數，可以有利於控制種子的接種濃度。
權利要求
1.基於液體深層發酵的樟芝無性孢子的製備方法及其應用，其特徵在於採用液體深層發酵大量產生無性孢子，該孢子可作為發酵種子接入新的發酵培養基，快速萌發後形成菌絲體。該孢子還可以用於長期保藏。
2.根據權利要求1所述的樟芝無性孢子的製備方法，其特徵在於(1)將樟芝斜面菌絲體接入液體種子搖瓶在M_32°C培養48-72小時得到種子液，在發酵搖瓶中培養288-336小時；(2)液體發酵培養基主要成分為葡萄糖20-40g/L、蛋白腖l-10g/L、硫酸鎂0.5-2g/L、 磷酸二氫鉀 l_4g/L，pH4-7 ；(3)從發酵液中分離形成的無性孢子和菌絲體。
3.根據權利要求2所述的樟芝液體發酵培養基，其特徵在於培養基組成中葡萄糖和蛋白腖的質量比為5 1 30 1。
4.根據權利要求1所述的樟芝無性孢子的應用，其特徵在於作為樟芝液體深層發酵的接種物，能夠縮短樟芝發酵周期、便於控制接種濃度。
全文摘要
本發明提供了一種基於液體深層發酵的樟芝無性孢子的製備方法及應用，目的是為了解決目前樟芝液體深層發酵周期較長、發酵過程和產物不穩定的情況，提供一種簡便的培養出樟芝無性孢子的方法，屬於生物工程領域。其特徵在於以樟芝(Antrodia camphorata)為出發菌株，以葡萄糖、蛋白腖、無機鹽為主要成分的液體培養基。採用該方法製備的無性孢子可作為發酵種子用於樟芝液體發酵。
文檔編號C12N3/00GK102174461SQ20111005330
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月7日 優先權日2011年3月7日
發明者史勁松, 竇文芳, 許正宏, 許泓瑜, 錢建瑛, 陸震鳴 申請人:江南大學