外泌多糖的製作方法

2023-04-25 19:29:26

專利名稱：外泌多糖的製作方法
技術領域：
本發明涉及外泌多糖及其在治療和預防炎性病症中的用途。
背景技術：
胃腸道在內部環境和來自食物來源的抗原以及外部環境中的微生物的不斷攻擊 之間提供保護性界面(Sanderson等，1993)。估計成年人腸內微生物區系的複雜生態系統 潛伏了 500種不同的細菌物種。由於毒素生成、黏膜侵入或致癌物和炎症應答的激活，這些 物種中的一些被認為是潛在有害的(Salminen，1998)。然而，已經鑑定出具有健康促進活性 的細菌菌株。益生菌是有益的細菌，其存在於健康腸微生物區系中，並且被定義為通過改善其 腸內微生物平衡給宿主動物帶來有益影響的活的微生物群。它們由在實驗室條件下培養 然後用於使由於例如壓力、疾病或者由於使用抗生素而引起的不平衡微生物區系恢復其平 衡的「友好細菌」組成。重要地是，已經證明攝入益生菌可能能夠通過降低局部促炎細胞 因子的產生穩定腸黏膜內的免疫屏障(Isolauri，1993 ;Majamaa，1997)。通過益生菌治療 所引起的固有微生物區系特性的改變被證明使某些克羅恩氏病(Malin，1996)、食物過敏 (Majamaa, 1997)和特應性溼疹(Isolauri，2000)特徵性的免疫紊亂發生逆轉。腸內微生物區系中存在的主要細菌物種之一為雙歧桿菌(Bifidobacterium)。在 腸內，雙歧桿菌使糖發酵生成乳酸。長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)基因組編碼很 多專門用於低聚糖分解代謝的蛋白質，使該細菌能夠使用所謂的「不易消化」的植物聚合物 或宿主來源的糖蛋白和糖綴合物。認為雙歧桿菌與其它胃腸細菌競爭以及其在胃腸區域的 細菌菌群中佔有大百分比的能力可能部分地歸因於其能夠使用多種分子以提供能量。儘管嬰兒雙歧桿菌(B. infantis)、短雙歧桿菌(B. breve)和長雙歧桿菌是嬰兒腸 內最大的細菌群，但據說雙歧桿菌僅是成年人體內第三或第四大的細菌群(並且僅佔成年 人糞便菌叢的3-6%)。實際上，人體內這些細菌的數量隨著年齡減少。在母乳餵養的嬰兒 體內，雙歧桿菌約構成他們腸內細菌的90% ；然而，這個數量在牛奶餵養的嬰兒體內較低。 當母乳餵養的嬰兒的食物改變成牛奶和固體食物時，人體內所發現的諸如擬桿菌和鏈球菌 乳酸桿菌(Str印tococci lactobacilli)的其它細菌的增加的數量加入到雙歧桿菌中來。已證明雙歧桿菌在免疫系統的調節中起作用。認為短雙歧桿菌釋放產生抗TNF作 用的能夠跨越腸屏障的代謝產物。已有報導稱通過給受試動物餵食乳酸細菌製劑降低了 白細胞介素-IO(IL-IO)缺陷小鼠內的黏膜炎症(Madsen，K等，1997 ；0』 Mahony等，2001 ； McCarthy等，2004)。WO 00/41168公開了一種從被切除並經清洗的人的胃腸道中分離出的 嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)菌株，其在人體內經口服消耗後具有顯著的免 疫調節作用。科學研究顯示出可能由微生物區系(消化系統的自然微生物固有種群)缺乏或 損害所引起的疾病的發病率增加，所述疾病例如胃腸道(GIT)感染、便秘、腸易激症候群 (IBS)、炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎、食物過敏、抗生素引起的腹瀉、心血管疾病以及諸如結直腸癌的某些癌症。有證據顯示單獨用嬰兒雙歧桿菌菌株進行治療後，IBS 症狀的嚴重程度降低(Whorwell等，2006)。有效性與系統免疫應答的調節相關，這表明作 用機制部分地是免疫介導的(O'Mahony等，2005)。本發明描述了從嬰兒雙歧桿菌中分離的化合物，其在體外複製嬰兒雙歧桿菌的免疫調節活性。發明簡述本發明提供了由嬰兒雙歧桿菌產生的表現出免疫調節特性的多糖。該多糖可以是 分泌型的(外泌多糖)或非分泌型的。根據本發明的一個方面，提供了包含以下結構的分離多糖[-β (1，3)-D-GalpNAc-β (1,4)-D-Glcp-]ηο所述多糖可以從細菌雙歧桿菌菌株中分離。所述菌株可以是例如NCIMB 41003的 菌株。根據本發明的另一個方面，提供了本發明的多糖作為藥物的用途。根據本發明的另一個方面，提供了本發明的多糖在製備用於治療或預防不良炎症 活動的藥物中的用途。根據本發明的另一個方面，提供了本發明的多糖在製備用於治療或預防不良胃腸 炎症活動的藥物中的用途。在一個實施方案中，所述胃腸炎症活動是克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、腸易激綜合 徵、貯袋炎(pouchitis)、感染後結腸炎、難辨梭菌(Clostridiumdifficile)相關性腹瀉、 輪狀病毒(Rotavirus)相關性腹瀉或感染後腹瀉。根據本發明的另一個方面，提供了本發明的多糖在製備用於治療或預防類風溼性 關節炎的藥物中的用途。根據本發明的另一個方面，提供了本發明的多糖在製備用於治療或預防自身免疫 疾病的藥物中的用途。根據本發明的另一個方面，提供了藥物組合物，其包含本發明的多糖和藥用可接 受載體。在本發明進一步的實施方案中，還提供了包含所述分離多糖的食品。例如所述食 品可以是選自酸乳酪、穀物、飲料等中的一種或多種。發明詳述現在將以非限制性實施例的方式描述本發明的各種優選特徵和實施方案。除非另外說明，本發明的實施將採用本領域技術人員能力範圍內的化學、微生物 學和免疫學的常規技術。這些技術在文獻中有所解釋。我們已經鑑定出具有免疫調節特性的雙歧桿菌分泌的外泌多糖。外泌多糖本發明涉及由嬰兒雙歧桿菌生物合成的外泌多糖。多糖由多種微生物合成並且通 常是與細胞表面保持相連的重複糖單元或是分泌型的或者兩者都是。它們在細胞應激反應 中起重要作用或者能夠促成病原體的毒力。最近，脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)多 糖的免疫調節作用已經得到證明(Mazmanian等，2005)。MiX要理解本文所有提及治療都包括根治療法、姑息療法和預防療法。特別優選哺乳動物的治療。人和獸的治療都在本發明的範圍之內。炎症炎症是對細胞損傷的局部應答，其症狀為毛細管擴張、白細胞浸潤、發紅、發熱、疼痛、腫脹和經常性功能喪失。在幾個水平上對炎症應答實施控制(綜述參見Henderson B.和Wilson Μ. 1998)。控制因子包括細胞因子、激素(例如氫化可的松)、前列腺素、活性 中間體和白三烯。細胞因子是低分子量的生物活性蛋白質，其參與免疫應答和炎症應答的產生和控 制，同時也調節發育、組織修復和造血。它們提供了白細胞本身之間以及與其他細胞類型之 間的溝通手段。大多數細胞因子是多效性的並且表達多重的生物重疊活性。細胞因子級聯和網狀系統控制炎症應答，而不是某一特定的細胞因子對某種特定 細胞類型的作用(Arai KI等，1990)。炎症應答的減弱引起適當的激活信號和其他炎症介 質濃度的降低，導致炎症應答的停止。腫瘤壞死因子α (TNFa)是關鍵的促炎細胞因子，因 為它啟動導致炎症狀態的細胞因子級聯和生物效應。因此，抑制TNFa的試劑目前正被用 於炎性疾病的治療，例如英夫利昔單抗(infliximab)。促炎細胞因子被認為在包括炎性腸病(IBD)在內的許多炎性疾病的發病機制中 起重要作用。目前治療IBD的治療方法旨在降低這些促炎細胞因子的水平。本發明的外泌 多糖可能在治療炎性病症中具有潛在的應用。這可以通過，例如增加諸如IL-10但不限於 IL-10的非炎性細胞因子的濃度，和/或降低炎性細胞因子的濃度來實現。炎件腸病炎性腸病(IBD)的特徵是慢性復發性腸炎症。IBD細分為克羅恩氏病和潰瘍性結 腸炎的表型。克羅恩氏病可能涉及胃腸道的任何部分，但最常見的是末端迴腸和結腸。在 大約10%的限於直腸和結腸的病例中，不能明確分類成克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎而將其 命名為「不確定性結腸炎」。這兩種疾病都包括皮膚、眼和關節的腸外炎症。克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎通常被歸類為自身免疫疾病，原因是這兩種疾病的特 點都是導致腸內層中慢性炎症的身體免疫系統的異常應答。在患有其他自身免疫疾病(特 別是強直性脊柱炎、銀屑病、硬化性膽管炎和多發性硬化)的個體中炎性腸病的患病率增 加。克羅恩氏病克羅恩氏病是引起消化或胃腸炎症的慢性疾病，其中免疫系統攻擊腸。雖然克羅恩氏病通常影響迴腸的末端和結腸的起始端，但它可能累及胃腸道的任 何部分。腸炎症是透壁的且不連續的；它可能包含肉芽腫或與腸瘻或肛周瘻相關。CARD15 基因和ABCBl基因的等位基因被認為與克羅恩氏病的易感性相關。潰瘍性結腸炎潰瘍性結腸炎是引起大腸內層炎症和疼痛的疾病。它是影響腸的非特異性慢性炎 性疾病。在炎症破壞細胞內層的部位形成潰瘍並出血。與克羅恩氏病相反，該炎症是連續 的且限於直腸和結腸黏膜層；沒有觀察到瘻和肉芽腫。在其病因學中遺傳和環境因素似乎都是重要的。Fuss等檢查了來自潰瘍性結腸 炎患者固有層的T細胞，並發現它們產生了比對照或克羅恩氏病細胞明顯更多量的IL13和 IL15，並且幾乎不產生IFN-γ。他們的結論是潰瘍性結腸炎與由產生IL13並對上皮細胞具有潛在細胞毒性的非典型NKT細胞介導的非典型的Th2應答有關。貯袋炎迴腸貯袋(ileal reservoir)的慢性和/或急性炎症，所謂的「貯袋炎」，是經常觀 察到的迴腸-肛門貯袋吻合術的長期併發症。在潰瘍性結腸炎患者中，貯袋炎的患病率從 低於10%到高於40%不等。「貯袋炎」的定義包括臨床症狀，內窺鏡檢查下肉眼可見的炎症 損害和貯袋黏膜嚴重的急性炎症的組織學證據。難辨梭菌相關件腹瀉難辨梭菌是厭氧的革蘭氏陽性孢子形成的桿菌，其於1935年首次從健康新生兒 的糞便菌叢中分離。直到1978年才建立起其與抗生素引發的假膜性結腸炎(PMC)的關聯。 幾乎所有的抗生素都已經與難辨梭菌腹瀉和結腸炎相關，包括萬古黴素和甲硝唑(用於其 治療)和癌症化學療法。關聯的頻率與使用頻率、給藥途徑和抗生素對結腸微生物區系的 影響有關。腸易激症候群腸易激症候群(IBS)是幹擾大腸(結腸)正常功能的慢性病症。其特點是一組症 狀_痙攣性腹痛、胃脹氣、便秘和腹瀉。IBS引起很大的不適和痛苦，但它不永久損害腸，並且不導致腸出血或任何嚴重的 疾病例如癌症。IBS的體徵和症狀在人與人之間有著很大的不同並且通常與許多其它疾病 並發。其它活件成分應當理解本發明的外泌多糖可以進行預防性給藥，或者作為治療方法單獨或與其 它益生菌和/或益生材料一起給藥。而且，所述細菌可以用作使用其它活性材料的預防或 治療方案的一部分，所述其它活性材料例如用於治療炎症或其它病症(特別是胃腸道的炎 症或其它病症)的材料。這種組合可以以單一製劑或分開的製劑，同時或不同時，使用相同 或不同的給藥途徑進行給藥。藥物組合物藥物組合物是包含治療有效量的藥物活性劑或由其組成的組合物。優選包含藥用 可接受載體、稀釋劑或賦形劑(包括其組合)。用於治療用途的可接受載體或稀釋劑是藥物 領域內公知的，並且在例如Remington』 sPharmaceutical Science中進行了描述。藥用載 體、賦形劑或稀釋劑的選擇可以考慮預期的給藥途徑和標準藥學實踐來做出選擇。該藥物 組合物可以包含作為載體、賦形劑或稀釋劑或除它們以外的任何合適的粘合劑、潤滑劑、助 懸劑、包衣劑、增溶劑。藥用可接受載體的實例包括，例如，水、鹽溶液、醇、矽酮、蠟、凡士林、植物油、聚乙 二醇、丙二醇、脂質體、糖類、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石粉、表面活性劑、矽酸、粘 性石蠟、芳香油、單脂肪酸甘油酯和二脂肪酸甘油酯、石化(petroethral)脂肪酸酯、羥甲 基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。在適當的情況下，所述藥物組合物可以通過以下任何一種或多種方式給藥吸入 給藥、以栓劑或陰道栓劑的形式給藥、以洗劑、溶液劑、乳膏劑、軟膏劑或噴粉的形式局部給 藥、通過使用皮膚貼劑給藥、以含有諸如澱粉或乳糖的賦形劑的片劑的形式或者以單獨或 與賦形劑混合在膠囊或卵狀小體中的形式口服給藥、或以含有調味劑或著色劑的酏劑、溶液劑或混懸劑形式給藥，或者它們可以進行腸胃外注射，例如海綿體內、靜脈內、肌內或皮 下注射給藥。為了腸胃外給藥，所述組合物最好可以以無菌水溶液形式使用，其可以含有其 它物質，例如足夠的鹽或單糖以使得該溶液與血液等滲。為了含服或舌下給藥，所述組合物 可以以常規方法配製的片劑或錠劑的形式給藥。可能存在取決於不同給藥系統的不同的組合物/製劑要求。舉例來說，本發明的 藥物組合物可以配製成使用微型泵或通過諸如鼻腔噴霧劑或吸入型氣霧劑或可吸收溶液 劑的黏膜途徑進行給藥，或者將所述組合物配製成可注射形式通過例如靜脈內、肌內或皮 下途徑進行腸胃外給藥。或者，所述製劑可以設計成通過兩種途徑給藥。現在將通過非限制性實施例並參照附圖對本發明的進一步優選的特徵和實施方 案進行描述。

圖1所示為對來源於雙歧桿菌35624 (NCIMB 41003)產生的條件培養基的外泌多 糖(PSI)的純化方案。圖2所示為雙歧桿菌35624 (NCIMB 41003)產生的外泌多糖(PSl)的結構。圖3表明了當與人外周血單核細胞在體外共同培養時，從雙歧桿菌35624[NCIMB 41003]純化的外泌多糖(PSl)表現出免疫調節活性。圖4證明在體外PSl限制了響應Toll樣受體4(TLR_4)刺激的促炎細胞因子的釋 放。圖5證明在體內PSl限制了響應Toll樣受體4(TLR_4)刺激的促炎細胞因子的釋放。圖6證明在體外PSl限制了響應Toll樣受體4(TLR-4)再刺激的促炎細胞因子的 釋放。在WO 00/42168中描述了所述菌株雙歧桿菌35624(NCIMB 41003)菌株，其全部內 容以引用的方式併入本文。所述菌株於1999年1月13日保藏於NCIMB。實施例1-來源於雙歧桿菌35624產生的條件培養基的外泌多糖(PSl)的純化和 結構測定純化.將IOOml添加了 0. 05 % (w/v)半胱氨酸的無菌MRS培養基(CM359MRS Broth, Oxoid Ltd. ，Basingstoke, Hampshire, England)置於接禾中了雙歧桿菌 35624 的 250ml無菌錐形瓶中。經接種的培養基在37°C的厭氧條件(10-01Pack_Anaero，Mitsubishi Gas Chemical Company-Ameica，NewYork, NY)下無振蕩培養。在以下概述的整個過程中， 未經接種的MRS培養基樣品用作培養基對照並與經接種的樣品進行相同的處理。生長48小時後，雙歧桿菌35624培養物已經達到穩定期並且顯示出OD 600nm為 大約3 (2-3 X IO9菌落形成單位/ml)。將該培養物轉移到聚碳酸酯離心管中並以40，000X g 離心 30 分鐘(JA-20 轉子，Beckman J2-21 離心機，Beckman Coulter, Inc.，Fullerton, CA)，得到澄清的上清液和緊密的細胞顆粒。小心地移除上清液(條件培養基)並用於外泌 多糖(EPS)的純化。將細胞顆粒丟棄。圖1所示為對來源於雙歧桿菌35624產生的條件培養基的EPS的純化方案。除非 另外提及，否則所有步驟均在冰上或4°C下進行。將80ml培養物上清液置於具有100,000 道爾頓的截留分子量(MW)的超濾裝置(VC1042Vivacell 100ml濃縮器，Vivascience, Hannover,Germany)中。樣品通過在臨床離心機中以2000X g離心進行濃縮。當體積達到約0. 5ml後，滲餘物(HiMW部分)用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)滲濾一次並濃縮回約0. 5ml。將 滲餘物轉移至標準的15ml離心管中。超濾裝置用4ml PBS衝洗，並且將該衝洗物與滲餘物 合併產生Hi麗滲餘物部分。將100%三氯乙酸(TCA)溶液加入到HiMW滲餘物部分中至TCA的最終濃度為20% (ν/ν)。樣品在冰上培養2小時，然後以8000Χ g離心20分鐘(JA-20轉子)。將含有EPS 的上清液轉移至30ml透紫外線玻璃(Corex)管中。將含有蛋白質的顆粒丟棄。用3體積 的冰冷的95%乙醇處理含有EPS的上清液並在-20°C下培養一整夜。然後該管以SOOOXg 離心20分鐘(JA-20轉子)。將上清液丟棄。將含有EPS的顆粒再次懸浮於5ml PBS中，然 後與上文一樣，用3體積的乙醇使其再次沉澱。該顆粒在冰上風乾60分鐘，然後再次懸浮 於 9mll0mM MgC12、 50mM Tris-HCl (pH 7.4)之中。為了移除核酸，各加入脫氧核糖核酸酶I(LS006331，WorthingtonBiochemical Corporation, Lakewood, NJ)禾口核糖核酸醇 A (R5250， Sigma-Aldrich Corporation, St Louis,MO)至其最終濃度為0. lmg/ml並在37°C下培養2小時。通過加入蛋白酶K(P2308， Sigma-Aldrich)至其最終濃度為0. 02mg/ml移除殘留的蛋白質，然後在37°C下培養該混 合物2小時。如下使蛋白酶K失去活性在70°C下培養15分鐘，然後加入苯甲基磺醯氟 (P7626, Sigma-Aldrich)至其最終濃度為0. 2mM，在室溫下持續15分鐘。與上文一樣，通過 加入3體積的乙醇，從溶液中使純化的EPS沉澱。將該顆粒再次懸浮於9ml的磷酸鹽緩衝 鹽水之中。將該再次懸浮的樣品置於具有3500的截留分子量的SnakeSkin透析管(68035， Pierce Biotechnology, Rockford，IL)中，然後在4°C下用7升水(更換2次)透析48小 時。為了使用Dubios等的標準苯酚/硫酸方法(Anal. Chem. 28，350-356 (1956))對存 在的多糖的量進行定量，移除一小部分的透析樣品。一旦測定了 EPS的濃度，就製備適當的 部分，在乾冰上冷凍，並凍幹至乾燥。凍幹的材料於-80°C下貯存。NMR^vIif · ^ Varian Inova 600-MHz i^if ft (Varian Medical Systems, Palo Alto, CA)上進行質子核磁共振(1H-NMR)分析。將凍幹的樣品溶於D20，並且在使之與氘充分 交換後，在25°C下得到波譜。化學位移以內標TSP作為參照。用States-Haberkom-Rubin正 交在相敏感模式下收集1H-1H相關譜(COSY)、全相關譜(TOCSY)、核歐沃豪斯效應譜(NOESY) 和質子_碳異核單量子相關譜(HSQC)數據。所有脈衝序列都由波譜儀供應商提供並且在 無變更下使用。將低能量預飽和應用到殘留HDO信號中。典型地，以512倍2048綜合數 據點和16-32掃描/增量收集數據組。TOCSY脈衝程序包含60-ms MLEV-17混合序列並且 NOESY混合時間是150ms。碳水化合物分析.通過對純化的雙歧桿菌35624EPS進行酸性甲醇分解所產生的 單糖甲基糖苷的過氧三甲基甲矽烷(TMS)衍生物的氣相色譜/質譜聯用法(GC/MS)進行糖 基成分分析(York等，(1986) ；Merkle, R. K.和Poppe，I. 1994)。為了糖基連接分析，對EPS 樣品進行全甲基化、解聚、還原和乙醯化。通過之前所述的GC-MS對所形成的部分甲基化的 糖醇乙酸酯(PMAAs)進行分析(York 等，(1986) ；Merkle, R. K.和 Poppe，I. (1994))。EPS的結構測定.用1H-NMR分析純化的EPS。波譜顯示出該材料全部由碳水化合物組成；沒有核 酸、蛋白質、脂質或小的有機汙染物的跡象。使用本領域中已知的和如上所述的實驗進行的二維核磁共振(2D-NMR)分析證實大多數存在的碳水化合物包含由二糖重複片段組成的 線性多糖。結合成分和連接分析的數據，這種多糖(命名為PSl)的結構為(1，3)_連 接-D-N-乙醯基半乳糖胺吡喃糖基(1，4)_連接-D-葡萄糖吡喃糖基_]η，其中η表明 該二糖單元重複η次，產生分子量大於100，OOO道爾頓的多糖。PSl的結構可以縮寫為 [-β (1,3)-D-GalpNAc-β (1，4)-D-Glcp-]η，並且如圖2中所示。注意在培養基對照樣品中 沒有檢測到PSl。t施仿I丨2-當與人免,瘡系統細胞,體夕卜共同培養時，嬰兒雙歧桿菌35624夕卜泌多糖 (PSl)具有免疫調節活件使用PBMC (外周血單核細胞)細胞因子誘導測定法對EPS部分進行測定。在該測 定中，通過密度梯度分離法將PBMCs從血液中分離，並且用對照培養基或增加濃度的源於 嬰兒雙歧桿菌35624的純化PSl在37°C下將其培養72小時(在青黴素和鏈黴素存在下)。 用 Meso Scale Discovery (MSD)試劑盒對上清液的 IL-I β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、 TNF-α和INF-Y水平進行測定，並用MSD板讀數器進行分析。圖3表明了該測定的結果。當用1-5 μ g/ml PSl刺激PBMCs時，PSl刺激所有受 試細胞因子的分泌。當使用10yg/ml PSl時，對很多細胞因子來說細胞因子刺激活性被降 低至背景水平。除了測試休眠的PBMCs，在有或無PSl刺激下，使用TLR-4配體脂多糖(LPS)激活 PBMCs0由於在預試驗中觀察到5 μ g/ml PSl為最佳劑量，在隨後的測定中使用該劑量。這 些結果在圖4中用以LPS+PS1刺激的細胞的平均細胞因子值減去單獨以LPS刺激的細胞的 細胞因子值來表示。當與PSl共同培養時，以LPS刺激的PBMCs分泌大幅減少的IL-6和顯 著減少的 IL-8、TNF- α 及 INF- γ。實施例3-當給膿毒症的鼠模型注射時，嬰兒雙歧桿菌35624外泌多糖(PSl)具有 抗炎活件向健康小鼠腹腔內注射PSl並觀察這些小鼠24小時。沒有記錄到明顯的痛苦體 徵，這表明動物對該多糖有良好的耐受力並且PSl沒有引發膿毒症或者促炎症反應。經24 小時觀察期後，為了引發膿毒症樣反應，以脂多糖(LPS)對動物進行腹腔內注射。2小時後 選取所有動物並在體外測定脾細胞細胞因子的分泌。當與單獨接受LPS的小鼠相比時，從 以PS1+LPS處理的小鼠中分離的脾細胞釋放的TNF-α顯著減少(圖5)。另外，在體外再次 以LPS刺激來自這些動物的脾細胞並且在來自之前與PSl接觸動物的脾細胞中再次記錄到 減弱的促炎細胞因子反應(圖6)。總之，這些數據證明源於嬰兒雙歧桿菌35624的EPSl具有免疫調節活性並且防止 LPS或TLR-4介導的炎症應答。儘管以上實驗描述了分泌型外泌多糖(PSl)，但設想該外泌多糖的非分泌形式，例 如該外泌多糖的與細胞締合的或與膜締合/結合的或囊狀的(capsular)形式，會以與分泌 型EPS相似的方式表現。本文所述的實驗設計為檢測分泌型EPS，但對本領域的技術人員來 說顯而易見的是，在EPS生成期間和在從細胞轉運或者釋放EPS之前，一部分分泌型EPS可 能與細胞結合(例如與細胞締合的或囊狀的)。本發明不限於本文以上所述的實施方案，其可以在細節上有所變化。參考文獻
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分離多糖，其包含[-β(1，3)-D-GalpNAc-β(1，4)-D-Glcp-]n結構。
2.來自細菌菌株的分離多糖，其包含(l,3)-D-GalpNAc-^(1，4)-D-Glcp-]n結構。
3.來自雙歧桿菌菌株的分離多糖，其包含(l,3)-D-GalpNAc-^(1,4)-D-Glcp-]n 結構。
4.來自雙歧桿菌菌株的分離多糖，其包含(l,3)-D-GalpNAc-^(1,4)-D-Glcp-]n 結構。
5.來自雙歧桿菌菌株NCIMB41003的分離多糖，其包含(1, 3)-D-GalpNAc-^ (1， 4)-D-Glcp-]n 結構。
6.權利要求1至5中任一項所述的多糖在製備用於治療或預防不良炎症活動的藥物中 的用途。
7.權利要求1至5中任一項所述的多糖在製備用於治療或預防不良胃腸炎症活動的藥 物中的用途。
8.權利要求7所述的用途，其中所述胃腸炎症活動是克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、腸易 激症候群、貯袋炎、感染後結腸炎、難辨梭菌(Clostridiumdifficile)相關性腹瀉、輪狀病 毒相關性腹瀉或者感染後腹瀉。
9.權利要求1至5中任一項所述的多糖在製備用於治療或預防類風溼性關節炎的藥物 中的用途。
10.權利要求1至5中任一項所述的多糖在製備用於治療或預防自身免疫疾病的藥物 中的用途。
11.藥物組合物，其包含權利要求1至5所述的多糖和藥用可接受載體。
12.食品，其包含權利要求1至5中任一項所述的多糖。
13.權利要求12所述的食品，其中所述食品是選自酸乳酪、穀物、飲料中的一種或多種。
14.基本上如上文所述的分離多糖。
15.基本上如上文所述的分離多糖的用途。
16.基本上如上文所述的藥物組合物。
17.基本上如上文所述的食品。
全文摘要
本發明涉及具有[-β(1，3)-D-GalpNAc-β(1，4)-D-Glcp-]n結構的分離多糖。該多糖可以來自雙歧桿菌菌株NCIMB41003。該多糖表現出免疫調節活性。
文檔編號C12P19/04GK101835806SQ200880014698
公開日2010年9月15日 申請日期2008年5月2日 優先權日2007年5月4日
發明者B·希爾, L·歐馬奧尼, R·A·格蘭特 申請人:營養健康有限公司;寶潔公司