一種穩定的蛋白藥物製劑及其製備方法

2023-04-26 04:42:41

專利名稱：一種穩定的蛋白藥物製劑及其製備方法
技術領域：
本發明涉及ー種蛋白藥物製劑，具體的說，涉及一種重組人白細胞介素11可注射藥物組合物，適用於皮下或靜脈等途徑給藥，用於實體瘤、非髓系白血病化療後III、IV度血小板減少症的治療。
背景技術：
人白細胞介素11 (Interleukin 11，IL-11)是與許多造血細胞相互作用的細胞因 子，最早是從IL-Ia刺激的哺乳動物骨髓細胞系PU-34的條件培養基中被鑑別的活性物質，可長期維持培養的血細胞的生存，隨後從人胚胎成纖維細胞系中克隆到IL-llcDNA。天然的IL-Il成熟蛋白含178個胺基酸，分子量19Kd ;不含半胱氨酸，因而缺少ニ硫鍵，但蛋白的結構卻相當穩定；沒有糖基化修飾；富含脯氨酸(12% )，亮氨酸(23% )及正電荷殘基(14% )，等電點為11.7。rhIL-11是由多種細胞產生並與多種細胞作用的細胞因子。rhIL-11可與其它因子協同作用刺激人的粒細胞，紅細胞及巨核細胞的前體細胞生長，最終導致血小板數量的増加。除了造血細胞，rhIL-11還作用於其它細胞，具有促進消化道上皮損傷的恢復、調節脂肪細胞分化等多種生物活性。1997年，美國Genetic Institute公司(GI)生產的重組人白細胞介素-ll(rhlL-ll)獲準上市，用於防止化療引起的再生性血小板減少症。GI於1993年獲得IL-Il基因(專利號US5215895)，1997年補充了該專利(專利號US5700664)，1998年獲得生產方法發明專利(專利號US5760189)，這些專利都在美國申請。但是作為蛋白藥物，rhIL-11其穩定性還是無法與常規化學藥物相比(Panayotatos ;Nikos，1998，US 5846935)，其穩定性在長期貯存時還是會受到多種環境因素的影響，例如對溫度，氧和紫外線高度敏感。由於這些因子的作用，可能發生多種物理或化學變化。物理變化包括降解、聚集(可溶與不可溶的聚體)；化學變化包括水解、氧化、脫酸氨作用等(Manning, et al. ,Phrmaceutical Research6 :903-918 (1989))。這些物理、化學變化，會導致rhIL-11在貯存期間不能保證其穩定性，產生ー些相關物質，從而導致以下影響一方面由於實際給藥劑量的變化而影響療效，另一方面因有關物質產生會引起副反應的產生。US6270757和US7033992公開了ー種包含rhIL-11和甘氨酸的製劑處方，該申請未進入中國。目前，已上市產品均採用類似專利公開的處方0. 5 5mg/ml的IL-Il蛋白、IOmM磷酸鈉緩衝液(pH = 7. 0)ヽ2. 3%甘氨酸(w/v)，lml/瓶的裝量裝於2ml的西林瓶中被凍幹。這種凍幹製劑的處方可以解決rhIL-11蛋白的水解、氧化、降解等問題，但其復溶後會有絮狀沉澱或纖維狀物質產生，有時會有乳光現象，根據2010版中國藥典第三部附錄VB的可見異物檢測方法檢測是不合格的。這些可見異物的存在，會產生ー時難以發現的、潛在的嚴重危害，例如炎症反應，毛細血管堵塞等。因此，研究出一種既能使rhIL-11蛋白穩定，又能消除可見異物，並適合於實際臨床使用的藥物製劑是極其有意義的。但是，到目前為止，尚未有這方面的研究報導。本發明涉及的就是此方面內容。

發明內容
本發明的ー個目的是提供ー種包含rhIL-11的新的藥物製劑，使其既能保持長期穩定性，井能保證凍幹藥物製劑在復溶後溶液的澄明度。藥劑中可見異物形成的通常由下列原因引起物理振蕩和溶液中蛋白質分子的相互作用以及在貯存小瓶中液-氣界面上蛋白質分子的相互作用。人們認為蛋白質分子吸附在氣-液界面上，其疏水基團向空氣中伸展而親水基團浸在水相中。一旦在表面這樣排布，蛋白質分子便容易聚集、形成顆粒和沉澱。人們還認為在諸如由於運輸或其它過程中發生 的振動而導致界面的伸縮過程中，吸附於氣-液和固-液界面的蛋白質發生進ー步的構象變化。這種振蕩能引起蛋白質纏結、聚集、形成顆粒並最終與其它吸附的蛋白質沉澱。另外，蛋白質在凍幹過程中由於預凍速率、升溫速率等凍幹曲線エ藝的影響導致可見異物產生。可見異物形成可以通過向含有蛋白質的組合物中摻入表面活性劑以降低溶液-空氣界面的表面張カ來控制。採用表面活性劑和乳化劑的傳統藥物穩定方法集中於在表面活性劑分子中同時含有疏水和親水性分子基團的兩親本質。因此該技術表明，通過選擇適當的表面活性劑作為相容劑可製得諸如水包油或油包水型不混溶分子的穩定溶液。用poloxamer 188 (PLURONIC F-68, BASF Vyadotte Corp.，Parsippany, NJ)對豆油進行的穩定的乳化作用便是ー個實例。另ー個實例是用聚山梨酯80(吐溫-80,polysorbate_80)來乳化水溶液中的油溶性維生素A、E和K以通過ロ服或血管途徑給藥。由Krantz等人的エ作，「糖醇-X X VIII.對吐溫80的毒理學、藥效學及臨床觀察」(Bull, of the School ofMed.，U. of MD. ,36,48(1951))為將聚山梨酯(polysorbate)列為ー種藥物成分奠定了エ作基礎，其USP/NF要求已發表在美國藥典X X II上。但是，出於對臨床應用安全性的考慮，使能混入用於注射入人體的非腸道組合物的表面活性劑的類型與特性受到限制。通常公認的具有使用歷史並列入美國藥典X X II的表面活性劑包括泊洛沙姆188 (poloxamer 188)和polysorbate聚合物。但是，由下述的實施例證明，它們中任何ー種在1%及更低濃度下単獨使用時，均不能對rhIL-11藥物組合提供完全的穩定作用。増大表面活性劑的濃度會出現毒副作用増加的危險，溶血的較早產生以及中性白細胞與血小板的可觀察到的變化，而中性白細胞與血小板均參與血液補體的活化。當poloxamerl88在有限的劑量下用作血液代用品並在血流中被稀釋10倍時，poloxamer 188在允許的非腸道溶液中的最高安全濃度為2. 7 %。類似地，已批准用於非腸道溶液20多年的吐溫80在100毫升或更大的溶液體積中的使用濃度很少高於0. I %。Krantz等(見上)鑑定狗在0. I %的polysorbate濃度下90分鐘時出現溶血。新生兒死亡與吐溫80的使用濃度高於1%有夫。因此，本領域需要能提供改進的蛋白蛋穩定穩定性的藥物組合物，該組合物中只包含那些被認為是安全的並包括在制定規章的權威批准的商用非腸道藥中的成分。本發明發現poloxamer 188表面活性劑與polysorbate (優選吐溫-20或吐溫-80)表面活性劑聯合應用可提高rhIL-11凍幹製劑復溶後的澄明度，使可見異物檢測合格，同時保證了凍幹製劑的穩定性。本發明特別提供了 rhIL-11的增溶/穩定方法。
在rhIL-11藥劑穩定性 研究過程中，選取了可見異物檢測，反相高效液相色譜分析作為考察指標，來觀察不同製劑處方對可見異物與蛋白穩定性的作用。這些方法均可從《中國藥典》(2010年版)獲得。通過以上各因素研究，發明人最終提供了ー種rhIL-11藥物新製劑，其包含以下組分0. 5-5mg/ml重組人白細胞介素-11，緩衝劑，等滲調節劑和表面活性剤，所述的表面活性劑含有 0. 01 I (w/v)的 poloxamer 188 和 0. 005 0. I (w/v)的polysorbate (聚山梨酉旨)，所述製劑的pH為6. 0-8. O。本發明特別針對下面發現兩種特定類型的表面活性劑的結合與其中任何ー種表面活性劑單獨使用相比，使藥物組合物的蛋白質穩定性有令人吃驚的改迸。特別是發現含有poloxamer 188表面活性劑與polysorbate (優選吐溫-80或吐溫-20)表面活性劑的混合物的藥物組合物可改善蛋白質藥劑的穩定性和對凝聚、顆粒形成及沉澱的抑制作用。與任何一種單獨使用相比這兩種類型表面活性劑的結合使用提供了改善的穩定性及對表面變性、凝聚、顆粒形成及沉澱的抑制作用。上述製劑中，用於穩定含有rhIL-11蛋白質的溶液時poloxamerl88的重量濃度(w/v)範圍為0.01% 1%，優選為0. 1% 0.6%，更優選為0. I 0.3%。聚山梨酯(polysorbate)表面活性劑成分優選為吐溫-80或吐溫-20,更優選為吐溫-80 ;重量濃度(w/v)範圍為0. 005% 0. 1%，優選為0. 01 0. 06%，更優選為0. 01 0. 03%。含有0.1 0.3% (w/v) poloxamer 188及0. 01 0. 03% (w/v)吐溫-80的混合物是最優選的。該混合物對防止rhIL-11的纖維狀物質形成特別有用，也可用於增進其它蛋白類、多肽藥物的穩定性。此poloxamer和聚山梨酯(polysorbate)表面活性劑的混合物可單獨使用或與其它表面活性劑混合使用。再者，本發明不限於ー種poloxamer表面活性劑與ー種聚山梨酯(polysorbate)表面活性劑表面活性劑混合,還包括一種或多種poloxamer表面活性劑與ー種或多種聚山梨酯(polysorbate)表面活性劑混合或是與其他表面活性劑混合。上述製劑中，所述的緩衝劑為能夠維持製劑在水溶液狀態下pH值為6. 0-8. 0的任何一種緩衝液，可任選自磷酸緩衝液、組氨酸緩衝液、琥珀酸鹽緩衝液、Tris緩衝液或ニこ醇胺緩衝液等，優選磷酸緩衝液；優選緩衝液的PH為6. 5-7. 5，更優選為7. 0 ;濃度範圍為
1-lOOmM，優選 5-40mM，最優選為 10_20mM。製劑中，所述的等滲調節劑可選用鹽(如氯化鈉、氯化鎂、磷酸鹽等)、多元醇(如甘露醇、山梨醇、甘油等)、糖(如蔗糖、乳糖、葡萄糖等)或胺基酸類(如甘氨酸、丙氨酸、或絲氨酸等)，優選甘氨酸(甘氨酸同時能起凍幹保護劑作用)；濃度範圍可根據製劑溶液所需的摩爾滲透壓濃度進行調節，優選為1% _4% (w/v)，更優選為2% -3% (w/v)，最優選為
2.3% (w/v)。根據需要，可將上述的藥物製劑製備為凍乾粉針。因此，本發明還涉及ー種包含rhIL-11的凍幹藥物組合物，所述藥物組合物在加入適量的藥學上可接受稀釋劑後，可還原成含0. 5-5mg/ml重組人白細胞介素-11，緩衝劑，等滲調節劑和表面活性劑的溶液，其中所述的表面活性劑含有0. 01 I (w/v)的poloxamer 188和0. 005 0. I (w/v)的polysorbate (聚山梨酯)，所述製劑溶液的pH為6. 0-8. O。上述的藥物製劑凍幹後的藥物組成含量可按其凍幹前的藥物體積量換算。優選的，上述的凍幹藥物製劑中包含0. 5-5mg的重組人白細胞介素-ll，10-40mg的等滲調節劑，ICT6-ICT4 摩爾數的緩衝鹽，0. I-IOmg 的 poloxamer 188 和 0. 05-lmg 的 polysorbate (聚山梨酷)。上述製劑中緩衝劑，等滲調節劑和表面活性劑的定義如前所述，藥學上可接受的稀釋劑可選擇注射用水、生理鹽水、低濃度葡萄糖溶液或注射用緩衝液等，優選注射用水。由於凍幹前的液體製劑基本上為等張和/或等滲的，因此凍幹後加入適量的注射用稀釋劑能夠還原形成等張或等滲溶液。進ー步地，還可在上述製劑中加入凍幹保護劑來進ー步抑制可見異物的產生。可選用的凍幹保護劑為糖類，例如蔗糖、海藻糖、羥こ基澱粉等，或是其混合物。優選的凍幹保護劑為蔗糖，加入蔗糖可抑止聚體的產生，其重量濃度範圍為0. 5 5% (w/v)，優選的濃度% 0. 5-2% (w/v),更優選的濃度為I % (w/v)。上述的含蔗糖的藥物製劑可進一歩製備為凍幹製劑。凍幹後的藥物組成含量可按其凍幹前的藥物體積量換算，優選的凍幹組合物中還包括5mg-50mg的蔗糖，更優選包括5-20mg的鹿糖。 優選的，上述藥物製劑中包含0. 5-5mg/ml重組人白細胞介素_11，I-IOOmM的磷酸緩衝劑，(w/v)的甘氨酸，0. 01 I (w/v)的 poloxamer 188 和 0. 005 0. I(w/v)的吐溫-80，所述的製劑的pH為6. 0-8. O。優選的，上述藥物製劑包含0. 5-5mg/ml重組人白細胞介素-11, 5_40mM的磷酸緩衝劑，2(w/v)的甘氨酸,0. 01 0. 6 (w/v)的 poloxamer 188 和 0.01% 0. 06% (w/v)的吐溫-80，所述的製劑的pH為6. 0-8. O。優選的，上述藥物製劑包含0. 5-5mg/ml重組人白細胞介素_11，10_20mM的磷酸緩衝劑，2(w/v)的甘氨酸,0. 01 0. 3 (w/v)的 poloxamer 188 和 0.01% 0. 03% (w/v)的吐溫-80，所述的製劑的pH為6. 5-7. 5。更優選的，上述藥物製劑包含0. 5-5mg/ml重組人白細胞介素_11，IOmM的磷酸緩衝劑,2. 3% (w/v)的甘氨酸，0.3% (w/v)的 poloxamer 188 和 0.02% (w/v)的吐溫-80,所述的製劑的pH為7.0。根據需要，可在上述優選的藥物製劑中加入為0. 5 5% (w/v)的蔗糖，優選的濃度為0. 5-2% (w/v)，更優選的濃度為1% (w/v)。根據需要，可將上述的藥物製劑製備為凍乾粉針，加入藥學上可接受的稀釋劑可將凍幹製劑還原成凍幹前的製劑溶液狀態，例如加入注射用水溶解。上述的藥物製劑凍幹後的藥物組成含量可按其凍幹前的藥物體積量換算，優選的按照臨床皮下注射Iml的體積量計算，上述的凍幹藥物製劑中包含0. 5-5mg的重組人白細胞介素-ll，10-40mg的甘氨酸，KT6-KT4摩爾數的磷酸氫ニ鈉和ニ氫鈉緩衝鹽，0. I-IOmg的poloxamer 188和0. 05-lmg的吐溫-80。若凍幹前藥物製劑中加入蔗糖，在凍幹後的組合物中還包括5mg-50mg的蔗糖，更優選包括5-20mg的鹿糖。其他優選範圍的凍幹藥物製劑組成含量按此類推。可以用本領域常用技術進行凍幹，例如凍幹循環包括3步冷凍、初次乾燥和二次乾燥。在凍幹過程中，製劑組分中的凍幹保護劑甘氨酸或甘氨酸與蔗糖混合物可對本發明製劑中重組人白介素-11蛋白起著穩定作用，即通過在凍幹的脫水期間保持蛋白質天然樣構象特性。凍幹後的組合物可用無菌水或合適的稀釋劑重配，用於注射。由於凍幹前的液體製劑基本上為等張和/或等滲的，因此凍幹後加入適量的注射用水能夠還原形成等張或等滲溶液。
因此，本發明還提供了一種用於製備重組人白細胞介素-11凍幹製劑的方法，所述方法包括以下步驟
(I)製備包含0. 5-5mg/ml重組人白細胞介素-11，緩衝劑，等滲調節劑和表面活性劑的溶液，所述的表面活性劑含有0. 01% 1% (w/v)的poloxamer 188和0. 005 0. I %(w/v)的polysorbate (聚山梨酉旨)，所述製劑的pH為6. 0-8. 0 ；(2)將所述製劑溶液凍幹。所述方法中各組成成分的定義和範圍選擇如前所述。polysorbate(聚山梨酷)可為吐溫-20或吐溫-80，優選吐溫-80。進ー步的，所述方法步驟(I)中可加入凍幹保護劑蔗糖，優選的濃度為0. 5 5%(w/v),優選的濃度為0. 5-2% (w/v),更優選的濃度為I % (w/v)。在本發明藥物組合的基礎上改變其中組分的濃度或加入其他物質，但對提高rhIL-11可見異物與穩定性沒有顯著改變，仍被視為本發明的一部分。為了進ー步闡明本發明，提供了下列例子，這些例子僅僅是為了進ー步說明本發明，並不意味著作為ー種限制。


圖 I :實例 8 中處方(2. 3% Gly+10mM pB+0. 3% poloxamerl88+0. 02% Tween-80)在0個月時的反相圖，反相純度為98. 32 %。圖 2 :實例 8 中處方(2. 3% Gly+10mM pB+0. 3% poloxamerl88+0. 02% Tween-80)在25°C條件下3個月時的反相圖，反相純度為98. 11%。圖3 :實例 8 中處方(2. 3% Gly+10mM pB+0. 3% poloxamerl88+0. 02% Tween-80)在40°C條件下3個月時的反相圖，反相純度為97. 47%。
具體實施例方式實例I :不同製劑處方對可見異物的影響rhIL-11蛋白與不同輔料組合，配成不同的製劑處方(處方中含3mg/ml的rhIL-11蛋白)，灌裝於2ml的西林瓶中進行凍幹，凍幹品用無菌水復溶後進行可見異物的檢測，檢測方法參考2010版中國藥典第三部附錄VB。具體結果見下表表I不同製劑處方對可見異物的影響
權利要求
1.一種含重組人白細胞介素-11的藥物製劑，所述製劑包含0. 5-5mg/ml重組人白細胞介素-11、緩衝劑、等滲調節劑和表面活性剤，所述的表面活性劑含有0. 01% 1% (w/v)的 poloxamer 188 和 0. 005 0. I (w/v)的 polysorbate (聚山梨酷)，所述製劑的 pH 為6. 0_8. O。
2.根據權利要求I所述的藥物製劑，其特徵在於所述製劑中緩衝劑選自磷酸緩衝液、組氨酸緩衝液、琥珀酸鹽緩衝液、Tris緩衝液或ニこ醇胺緩衝液等，濃度範圍為1-lOOmM，pH 範圍為 6. 0-8.0。
3.根據權利要求I所述的藥物製劑，其特徵在於所述製劑中等滲調節劑選自鹽、多元醇、糖或胺基酸類，濃度範圍為1% -4% (w/v)
4.根據權利要求I所述的藥物製劑，其特徵在於所述製劑中polysorbate(聚山梨酷)為吐溫-20或吐溫-80。
5.根據權利要求I所述的藥物製劑，其特徵在於所述製劑包含0.5-5mg/ml重組人白細胞介素-11，I-IOOmM的磷酸緩衝劑，I %-4% (w/v)的甘氨酸，0. 01% 1% (w/v)的poloxamer 188 和 0. 005 ~ 0. I % (w/v)的吐溫-80,所述的製劑的 pH 為 6. 0-8. O。
6.根據權利要求I所述的藥物製劑，其特徵在於所述製劑包含0.5-5mg/ml重組人白細胞介素-ll，5-40mM的磷酸緩衝劑，2%-3% (w/v)的甘氨酸，0. 01 % 0. 6 % (w/v)的poloxamer 188 和 0. 01 0. 06% (w/v)的吐溫-80,所述的製劑的 pH 為 6. 0-8. O。
7.根據權利要求1-6任ー項所述的藥物製劑，其特徵在於所述製劑還含有凍幹保護劑蔗糖，濃度為0. 5 5% (w/v)。
8.根據權利要求7所述的藥物製劑，其特徵在於，所述藥物製劑可製備為凍乾粉針。
9.一種含重組人白細胞介素-11的凍幹藥物組合物,所述組合物包含0. 5-5mg的重組人白細胞介素-ll，10-40mg的等滲調節劑，10-6-10-4摩爾數的緩衝鹽，0. I-IOmg的poloxamer 188 和 0. 05-lmg 的 polysorbate (聚山梨酉旨)。
10.一種重組人白細胞介素-11凍幹製劑的製備方法，所述方法包括以下步驟 (1)製備包含0.5-5mg/ml重組人白細胞介素-11，緩衝劑，等滲調節劑和表面活性劑的溶液，所述的表面活性劑含有0. 01% 1% (w/v)的poloxamer 188和0. 005 0. 1% (w/v)的polysorbate (聚山梨酉旨)，所述製劑的pH為6. 0-8. 0 ； (2)將所述製劑溶液凍幹。
全文摘要
本發明涉及一種重組人白細胞介素-11(rhIL-11)藥物新製劑，其包含以下組分0.5-5mg/ml重組人白細胞介素-11，緩衝劑，等滲調節劑和表面活性劑，所述的表面活性劑含有0.01％～1％(w/v)的poloxamer 188和0.005～0.1％(w/v)的polysorbate(聚山梨酯)，所述製劑的pH為6.0-8.0。本發明在現有技術基礎上添加的poloxamer 188表面活性劑與polysorbate表面活性劑聯合應用可提高rhIL-11凍幹製劑復溶後的澄明度，使可見異物檢測合格，同時保證了凍幹製劑的穩定性。
文檔編號A61P1/00GK102648978SQ201110097990
公開日2012年8月29日 申請日期2011年4月19日 優先權日2011年4月19日
發明者嚴春霞, 劉曉妮, 徐文長, 汪軍遠, 馬南佳, 馬國昌 申請人:杭州九源基因工程有限公司