一株東方伊薩酵母及其全細胞轉化產胞二磷膽鹼的方法
2023-05-05 00:21:11
專利名稱：一株東方伊薩酵母及其全細胞轉化產胞二磷膽鹼的方法
技術領域：
一株東方伊薩酵母及其全細胞轉化產胞二磷膽鹼的方法，涉及到胞二磷膽鹼的製備，屬於生物製藥技術領域。
背景技術：
胞二磷膽鹼，又名胞磷膽鹼，化學名稱是膽鹼胞嘧啶_5』 - 二磷酸酯單納鹽，是卵磷脂生物合成的前體。補充外源性胞二磷膽鹼即能激活卵磷脂的生物合成，刺激腦幹網狀結構的興奮，提高甦醒閾值，恢復神經組織機能，改善腦代謝和神經傳導，提高患者的意識水平。此外，胞二磷膽鹼還是一種重要的核酸藥物，能調節腦血管運動張力，改善大腦代謝功能。胞二磷膽鹼作用的靶器官是肝臟和腦組織，臨床用以治療顱腦外傷及顱腦術後昏迷、 帕金森氏綜合症、遲發性運動障礙、神經性耳聾和耳鳴、腦血管疾病以及小腦與脊髓共濟失調。鑑於胞二磷膽鹼的廣泛應用，其製備技術成為較受關注的研究課題。胞二磷膽鹼的生產方法有化學合成法、酶法和微生物轉化法，早在20世紀50年代就有報導通過化學法合成胞二磷膽鹼，但化學合成的胞二磷膽鹼產品不適合藥用，隨後採用酶促的方法合成胞二磷膽鹼，但成本較高。目前常用的方法是微生物轉化法，但存在著轉化率、產量不高的問題。微生物細胞轉化製備胞二磷膽鹼主要是通過ATP的再生體系和胞二磷膽鹼合成酶系。ATP的再生是通過糖酵解途徑(EMP)來實現，胞二磷膽鹼合成酶系包括核苷酸激酶、 核苷二磷酸激酶、膽鹼激酶和磷酸膽鹼胞苷轉移酶，ATP是胞二磷膽鹼合成過程中磷酸供體。ATP的再生體系與胞二磷膽鹼合成酶系偶聯時，反應體系中只需存在葡萄糖、磷酸鹽、 5』 -胞苷酸和磷酸膽鹼即可合成胞二磷膽鹼。因此，胞二磷膽鹼的合成速率取決於ATP再生的速率、胞二磷膽鹼合成酶系的速率以及二者偶聯的速率。東方伊薩酵母α oriental is)細胞中ATP的再生量取決於EMP途徑，而通過添加鉀離子、鎂離子和錳離子等離子可以改變代謝流向，提高ATP的再生速率，從而與胞二磷膽鹼酶系速率相匹配，實現高效製備胞二磷膽鹼。
發明內容
本發明的目的是使用東方伊薩酵母α oriental is)高效製備胞二磷膽鹼。本發明的思路是以磷酸膽鹼、5』 -胞苷酸或其前體物質為底物，以葡萄糖為能量供體，通過無機鹽提高ATP再生速率，利用東方伊薩酵母(/. oriental is)透性細胞製備胞
二磷膽鹼。本發明主要包括以下四個方面
(1)胞二磷膽鹼的製備是以磷酸膽鹼、5』 -胞苷酸為底物，以葡萄糖為能量供體，在水溶液中通過透性酵母細胞製備胞二磷膽鹼。(2)上述(1)的製備方法中，所使用的酵母細胞為東方伊薩酵母(/. orimiahi)Zl，中國典型培養物保藏中心，菌種編號為CCTCC Ν0:Μ 2011272。
(3)上述(1)的製備方法中，葡萄糖為能量供體，一方面提供菌體的能量需求，另一方面為胞二磷膽鹼合成酶系提供ATP，本發明中通過添加鉀離子、鎂離子和錳離子中的一種或組合提高ATP的再生速率。(4)上述(1)的製備方法中，使用的酵母細胞經培養離心後得到的酵母全細胞， 並在製備的水溶液中添加甲苯來提高細胞的透性，以提高胞二磷膽鹼合成酶系的速率。本發明的技術方案一株東方伊薩酵母，其命名為東方伊薩酵母ijssatchenkia orimiahi)Z1，已保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 2011272。用所述東方伊薩酵母全細胞轉化產胞二磷膽鹼的方法，以磷酸膽鹼和5』 -胞苷酸為底物，以葡萄糖為能量供體，通過添加無機離子提高ATP再生速率，利用東方伊薩酵母 (/. oriental is) CCTCC NO :M 2011272 透性細胞製備胞二磷膽鹼。胞二磷膽鹼的製備是在水溶液中進行，反應溫度為2(T40°C，pH為壙9，反應時間為6 24h。胞二磷膽鹼製備中底物磷酸膽鹼的起始反應濃度為l(Tl00ymol/mL，5』 -胞苷酸的起始反應濃度為1(Γ50 μ mol/mL ；能量供體葡萄糖的起始反應濃度為5(Γ500 μ mol/mL ； 添加的無機離子為鉀離子、鎂離子、錳離子的無機鹽形式，可以是磷酸鹽、硫酸鹽等，添加離子的方式可以是一種或幾種離子的組合，其中鉀離子的起始反應濃度為(Γ200 μ mol/mL，鎂離子的起始反應濃度為(T200ymol/mL，錳離子的起始反應濃度為(Γ50 μ mol/mL ；使用的酵母全細胞為東方伊薩酵母O· oriental is) CCTCC NO :M 2011272，通過培養離心得到的酵母全細胞，在反應中添加形式是酵母泥，起始添加濃度為20(Tl000g/L ；在反應中通過添加甲苯來改變酵母細胞的通透性，甲苯的起始反應濃度為0.廣10mL/L。本發明的有益效果本發明中以葡萄糖為能量供體，一方面提供菌體的能量需求， 另一方面為胞二磷膽鹼合成酶系提供ATP;通過添加鉀離子、鎂離子和錳離子中的一種或組合改變代謝流向，提高ATP的再生速率，從而與胞二磷膽鹼酶系速率相匹配，實現高效製備胞二磷膽鹼。使用的酵母細胞為經培養離心後得到酵母全細胞，並在製備的水溶液中添加甲苯來提高細胞的透性，以提高胞二磷膽鹼合成酶系的速率。生物材料樣品保藏東方伊薩酵母ijssatchenkia oriental is) Zl,已保藏於中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢武漢大學，保藏日期2011年7月四日，保藏編號為 CCTCC NO :M 2011272。
圖1本發明製備胞二磷膽鹼主要代謝途徑示意圖。
具體實施例方式實施例1
東方伊薩酵母的培養，所用的酵母培養基為葡萄糖50 g/L，尿素2.0 g/L，磷酸二氫鉀 1. 5 g/L,七水合硫酸鎂0. 5 g/L,七水合硫酸鋅4. 0 mg/L,七水合硫酸鐵3. 0 mg/L,四水合硫酸錳0. 3 mg/L，無水氯化鈣1. 0 mg/L,生物素0. 05 mg/L,以蒸餾水定容。東方伊薩酵母的接種量為10%，於30° C搖床培養M h，然後4500r/min離心lOmin，棄上清後得到酵母泥，
4即可用於製備胞二磷膽鹼。在反應器中配製由25ymol/mL磷酸膽鹼，lOymol/mL 5，-胞苷酸，200 μ mol/mL 葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂以及上述培養基培養離心得到的酵母泥2000g和水組成的反應液10L，氫氧化鈉調節pH 6. 0，於32° C轉化10h，反應結束後，測定反應液中胞二磷膽鹼的產量為2. 0 g/L，轉化率達到61. 9%。實施例2
在反應器中配製由25 μ mol/mL磷酸膽鹼，10 μ mol/mL 5』 -胞苷酸，200 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂以及按照實施例1所述的培養東方伊薩酵母的方法培養離心得到的酵母泥2000g和水組成的反應液10L，氫氧化鈉調節pH 6. 0，並添加0. lmL/L的甲苯，於32° C轉化10h，反應結束後，測定反應液中胞二磷膽鹼的產量為2. 4g/L，轉化率達到 74. 2%ο實施例3
在反應器中配製由30 μ mol/mL磷酸膽鹼，20 μ mol/mL 5』 -胞苷酸，300 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂，10 μ mol/mL磷酸二氫鉀以及按照實施例1所述的培養東方伊薩酵母的方法培養離心得到的酵母泥5000g和水組成的反應液10L，氫氧化鈉調節pH 5.0， 並添加0. 5mL/L的甲苯，於32° C轉化10h，反應結束後，測定反應液中胞二磷膽鹼的產量為 5. lg/L，轉化率達到78. 9%。實施例4
在反應器中配製由50 μ mol/mL磷酸膽鹼，40 μ mol/mL 5』 -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂，10 μ mol/mL磷酸二氫鉀以及按照實施例1所述的培養東方伊薩酵母的方法培養離心得到的酵母泥5000g和水組成的反應液10L，氫氧化鈉調節pH 6.0， 並添加0. 5mL/L的甲苯，於32° C轉化10h，反應結束後，測定反應液中胞二磷膽鹼的產量為 9.5 g/L，轉化率達到73. 4%。實施例5
在反應器中配製由50 μ mol/mL磷酸膽鹼，40 μ mol/mL 5』 -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂，1 μ mol/mL硫酸錳以及按照實施例1所述的培養東方伊薩酵母的方法培養離心得到的酵母泥8000g和水組成的反應液10L，氫氧化鈉調節pH 8.0，並添加0. 5mL/L的甲苯，於32° C轉化10h，反應結束後，測定反應液中胞二磷膽鹼的產量為IOg/ L，轉化率達到77. 4%。實施例6
在反應器中配製由50 μ mol/mL磷酸膽鹼，40 μ mol/mL 5』 -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂，10 μ mol/mL磷酸二氫鉀以及按照案例1所述的培養東方伊薩酵母的方法培養離心得到的酵母泥7500g和水組成的反應液15L，氫氧化鈉調節pH6. 0， 並添加lmL/L的甲苯，於32°C轉化他，反應結束後，測定反應液中胞二磷膽鹼的產量為 10. 6g/L，轉化率達到82%。實施例7
在反應器中配製由50 μ mol/mL磷酸膽鹼，40 μ mol/mL 5』 -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂，10 μ mol/mL磷酸二氫鉀，1 μ mol/mL硫酸錳以及按照實施例1 所述的培養東方伊薩酵母的方法培養離心得到的酵母泥5000g和水組成的反應液10L，氫氧化鈉調節pH 6. 8，，並添加0. 5mL/L的甲苯，於34° C轉化10h，反應結束後，測定反應液中胞二磷膽鹼的產量為10. 4 g/L，轉化率達到80. 4%。實施例8
在反應器中配製由5(^11101/1^磷酸膽鹼，4(^11101/1^ 5』 -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂，10 μ mol/mL磷酸二氫鉀，1 μ mol/mL硫酸錳以及按照實施例1 所述的培養東方伊薩酵母的方法培養離心得到的酵母泥5000g和水組成的反應液10L，氫氧化鈉調節PH 6.0，並添加1!^/1的甲苯，於30°(轉化10h，反應結束後，測定反應液中胞二磷膽鹼的產量為10. 8g/L，轉化率達到83. 5%。實施例9
在反應器中配製由50 μ mol/mL磷酸膽鹼，40 μ mol/mL 5』 -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，10 μ mol/mL磷酸二氫鉀，1 μ mol/mL硫酸錳以及按照實施例1所述的培養東方伊薩酵母的方法培養離心得到的酵母泥6000g和水組成的反應液12L，氫氧化鈉調節pH 6. 5，並添加 5mL/L的甲苯，於32° C轉化12h，反應結束後，測定反應液中胞二磷膽鹼的產量為10. 6g/L， 轉化率達到82%。實施例10
在反應器中配製由50 μ mol/mL磷酸膽鹼，40 μ mol/mL 5』 -胞苷酸，400 μ mol/mL葡萄糖，5 μ mol/mL七水合硫酸鎂，10 μ mol/mL磷酸二氫鉀，1 μ mol/mL硫酸錳以及按照實施例1 所述的培養東方伊薩酵母的方法培養離心得到的酵母泥5000g和水組成的反應液10L，氫氧化鈉調節PH 6.0,並添加lmL/L的甲苯，於32°C轉化12h，反應結束後，測定反應液中胞二磷膽鹼的產量為11. 2g/L，轉化率達到86. 6%。
權利要求
1.一株東方伊薩酵母，其命名為東方伊薩酵母Os1SaicAez^ia orimi^is) Z1，已保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 2011272。
2.用權利要求1所述東方伊薩酵母全細胞轉化產胞二磷膽鹼的方法，其特徵在於以磷酸膽鹼和5』 -胞苷酸為底物，以葡萄糖為能量供體，通過添加無機離子提高ATP再生速率， 利用東方伊薩酵母CCTCC NO =M 2011272透性細胞製備胞二磷膽鹼；胞二磷膽鹼的製備是在水溶液中進行的，反應溫度是2(T40°C，pH4、，反應時間為6l4h ；所述的底物中，磷酸膽鹼的起始濃度為l(Tl00ymol/mL，5』 -胞苷酸的起始濃度為 10 50ymol/mL ；所述的能量供體葡萄糖的起始濃度為5(Γ500 μ mol/mL ；所述添加的無機離子為鉀離子、鎂離子、錳離子中的一種或幾種的組合；鉀離子的起始反應濃度為(Γ200 μ mol/mL，鎂離子的起始反應濃度為(Γ200 μ mol/mL，錳離子的起始反應濃度為0 50 μ mol/mL ；所使用的東方伊薩酵母全細胞為CCTCC NO =M 2011272通過培養離心得到的酵母全細胞，在反應中添加形式是酵母泥，起始添加濃度為20(Tl000g/L ；所述的東方伊薩酵母透性細胞是指在反應中通過添加甲苯處理改變酵母細胞的通透性，甲苯的起始反應濃度為0.廣10mL/L。
全文摘要
一株東方伊薩酵母及其全細胞轉化產胞二磷膽鹼的方法，屬於生物製藥技術領域。本發明利用東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)Z1，即CCTCCNOM2011272，全細胞製備胞二磷膽鹼，以磷酸膽鹼和5』-胞苷酸為底物，以葡萄糖為能量供體，通過添加無機離子提高ATP再生效率；以葡萄糖為能量供體，一方面提供菌體的能量需求，另一方面為胞二磷膽鹼合成酶系提供ATP；通過添加鉀離子、鎂離子和錳離子中的一種或組合改變代謝流向，提高ATP的再生速率，從而與胞二磷膽鹼酶系速率相匹配，實現高效製備胞二磷膽鹼；使用酵母全細胞，並在製備過程的水溶液中添加甲苯來提高細胞的透性，以提高胞二磷膽鹼合成酶系的速率。
文檔編號C12N1/16GK102286386SQ201110232740
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月15日 優先權日2011年8月15日
發明者丁重陽, 尤翠萍, 張梁, 石貴陽, 顧正華 申請人:江南大學