用於DDT檢測的二氧化鈦納米粒子螢光探針的製備方法與流程

2023-05-04 12:54:16

本發明涉及材料科學領域，特別涉及用於ddt檢測的二氧化鈦納米粒子螢光探針的製備方法。

背景技術：

在安全方面，農藥的使用為我們帶來巨大效益的同時也對我國的生態壞境和人體健康造成了嚴重的威脅。尤其是農藥在農牧產品和食品中的殘留，對人體具有慢性毒性、直接中毒、「三致」（致癌、致畸、致突變）效應和環境激素效應。農藥殘留對我國食品安全構成了長期的、嚴重的威脅，公眾對農產品和食品的安全感明顯下降，同時也嚴重影響了我國農產品在國際市場的競爭力。因此，近年來，在對痕量農藥的檢測和相關的傳感器陣列的探索已經引起了社會研究機構廣泛的關注和富有成效的探索。目前檢測ddt的方法很多，色譜法中，高效液相色譜法、液質和氣質聯用是較常用的方法。這些傳統分析技術能夠滿足分析中的基本要求，如選擇性，可靠性，準確性和可重複性，但是，這些檢測方法需要精密的設備和專業的操作人員，所以這些方法是昂貴的、耗時的和繁瑣笨重的，而且檢測中，樣品必須是脫離檢測現場送往實驗室去分析，不能夠做到實時實地的檢測。現在應用比較熱門的檢測技術是生物傳感器法和酶分析法。生物傳感器（biosensor）是一種以生物材料為敏感識別元件，由信號轉換元件和信號傳遞元件組成的一種裝置，有高靈敏度、較強的特異性、操作方便、儀器設備費用低等優勢，但現有的生物傳感器仍存在檢測結果不穩定、重現性差和使用壽命短等問題。酶分析法主要是基於有機磷和氨基甲酸脂類農藥對乙醯膽鹼酯酶活性的抑制作用而發展起的一種分析法，檢測過程簡單，但這種分析方法的準確度較差，檢出限大多在ppm級，造成假陽性、假陰性，一般用於定性分析。綜上所述，有必要尋求對環境中ddt目標分析物提供一種高選擇性、高靈敏、快速響應、低成本和原位檢測的方法。

在應用方面，如何提高檢測技術對ddt目標分析物的選擇性。分子印跡技術作為一種成熟的技術廣泛應用於合成具有特異性識別位點的分子印跡聚合物（molecularlyimprintedpolymers，mips）。所製備的分子印跡聚合物具有廣泛的適用性、良好的可塑性、穩定性和高選擇性等優點，其內部的識別位點能夠有選擇性地與模板分子結合，從而實現選擇性識別。mips的製備過程一般分為三步：（1）功能單體與模板分子（目標分析物或類似物）通過共價或非共價作用形成單體-模板複合物；（2）在引發劑或者光誘導的條件下，該複合物與交聯劑發生共聚作用，得到高度交聯的剛性高分子聚合物；（3）將模板分子從聚合物骨架中去除，在三維交聯聚合物中留下了在形狀、大小和功能等方面都與模板分子相匹配的特異性印跡結合位點，目標分析物可以通過結合位點有選擇性地連接到聚合物中。從製備過程可知，通過印跡技術可以得到事先設定的結構物質；而且通過交聯，提高了聚合物的穩定性和抵抗環境幹擾的能力；聚合物表面的識別位點對目標分析物有高效的選擇性。因為印跡聚合物的這些特異性，在化學與生物傳感器（liangrn.angew.chem.int.ed.,2010,49(14):2556-2559;alizadeht.biosens.bioelectron.,2010,25(5):1166-1172;lakshmid.anal.chem.,2009,81(9):3576-3584.）、固相萃取（sanchor.chem.soc.rev.,2009,38(3):797-805;liy.nanoscale,2011,3(1):280-287;xusf.j.mater.chem.,2011,21(32):12047-12053.）、催化（orozcoj.j.am.chem.soc.,2013,135(14):5336-5339;lisj.adv.funct.mater.,2011,21(6):1194-1200;wulffg.acc.chem.res.,2012,45(2):239-247.）和膜分離（wangjy.j.membr.sci.,2009,331(1-2):84-90;tassellif.j.membr.sci.,2008,320(1-2):167-172;jiangy.j.membr.sci.,2006,280(1-2):876-882.）等領域有廣泛的應用前景。近年來，發明專利（cn105403694）:「一種用於探測百草枯分子的ps@sio2人工抗體的製備方法」報導了以二氧化矽包覆聚苯乙烯（polystyrene,ps）微球，形成芯-殼結構。製備印跡聚合物的最後一步，洗脫sio2殼層中的模板分子，sio2殼層的內部形成具有與模板分子結構、大小和功能基互補的空穴，得到的印跡微球具有對目標分析物分子的特異性識別位點，實現了對百草枯分子的選擇性識別和探測。2012年，華東師範大學碩士張丹，在畢業論文「納米材料表面分子印跡技術研究及其對農藥的特異性識別」中，利用分子印跡-電化學聯用技術,以功能合金納米顆粒、多壁碳納米管等多種具有良好導電性的納米材料作為反應載體，合成具有良好選擇性的新型分子印跡材料，成功實現了對實際樣品中幾種常見農藥的高靈敏的特異性檢測。

印跡技術可以提高對目標分析物的選擇性，但是在分析檢測應用中缺乏信號傳輸能力，不能達到快速響應的要求。而螢光分子是對目標分析物的高靈敏響應理想材料。在各種信號傳感器中，基於螢光「關」或螢光「開」機理的光學可尋址傳感器已經被證明是研究者在許多挑戰的環境中所期盼對各種小分子目標分析物檢測的方法。螢光傳感器一般由三部分構成：螢光基團、識別基團和連接基團。螢光基團是指能將自身變化轉變為螢光信號的部分；識別基團是指能與目標分析物結合併發生一定變化的部分；連接基團則是指將二者連接起來的部分。基於不同的原理，有光誘導電子轉移（pet）螢光傳感器、螢光共振能量轉移螢光傳感器、稀土螯合發光螢光傳感器和分子內電荷轉移螢光傳感器。基於不同目標分析物和反應條件，選擇不同的螢光反應器。基於螢光共振能量轉移原理，公開了發明專利（cn104359880）「對痕量百草枯檢測的cdte量子點螢光探針的化學製備方法」，得到的cdte量子點螢光探針，其表面帶負電荷的羧基與帶正電荷的目標分析分子百草枯通過正負電荷的靜電作用，與百草枯在空間上相互接近時，通過螢光共振能量轉移原理，發射光譜為紅色的cdte量子點螢光探針的發光譜帶能被綠色的百草枯分子吸收，利用cdte量子點螢光強度的改變，實現了對痕量百草枯的檢測。基於稀土螯合原理，公開了發明專利（cn106092983）「一種檢測有機氯農藥y2o3：tb3+@sio2-nh2螢光傳感器陣列的製備方法」，y2o3：tb3+@sio2-nh2螢光傳感器陣列內部的印跡識別位點可與有機氯農藥分子（目標分子）相互作用，使有機氯農藥分子與識別位點上的tb3+配位形成有機配體，利用金屬離子tb3+螢光強度的改變實現對有機氯農藥分子的檢測。2016年，安徽大學碩士餘升龍在畢業論文「基於香豆素和喹啉母體的小分子螢光化學傳感器的研究」中，第一個報導了一個基於分子內電荷轉移（ict）機理的雙光子螢光探針（tnq），用於檢測水合肼，且能夠很好地應用於環境中水合肼蒸汽的檢測和生物成像中。本發明中，基於光誘導分子轉移原理，合成了一種對ddt檢測的二氧化鈦納米粒子螢光探針。二氧化鈦納米粒子螢光探針內部的印跡識別位點上的氨基可與進入識別位點的ddt分子相互作用，氨基上氫原子與ddt分子上的氯原子形成氫鍵，使得氨基穩定，阻礙了氨基上的電子向識別位點上的螢光基團轉移，抑制了識別位點上螢光基團的螢光淬滅，導致識別位點上螢光基團的螢光增強，實現對ddt的檢測。而且，近年來，光誘導電子轉移（pet）反應在感應螢光分子識別方面取得了很大進展。由於該檢測方法的高信號輸出和可靠的檢測結果，螢光「開」機理的化學傳感器對ddt類農藥的檢測是極其有利的。檢測ddt是否進入分子印跡聚合物識別位點就是依照光誘導電子轉移的機理。ddt分子進入二氧化鈦納米粒子螢光探針內部的印跡識別位點與識別位點上的氨丙基可相互作用，氨丙基上的氫原子與ddt分子上的氯原子形成氫鍵，使氨丙基穩定，光激發時，阻止氨丙基上氮原子的電子轉移到nbd-apts複合物，根據光誘導電子轉移機理，導致複合物螢光強度的增強，螢光強度增加的程度取決於氫鍵作用力的大小。2005年，中國科學院大連化學物理研究所公布了發明專利（cn1632538a）「一種農藥殘留高靈敏度快速檢測的方法」，報導的方法即螢光傳感器。以螢光探針為指示劑，指示有機磷農藥和氨基甲酸酯類農藥對膽鹼酯酶活性的抑制程度，或者指示所訴農藥對有機磷水解酶水解反應的進程，通過螢光強度的變化測定農藥殘留量。該方法對有機磷農藥和氨基甲酸酯類農藥的檢測限，以呋喃丹為標準物質，可以達到2μg/kg。

綜上所述，印跡技術的高效選擇性和螢光傳感器的快速響應，得到越來越多研究者的青睞。而將兩者結合，即將分子印跡聚合物作為傳感器材料的識別元件構建，用來檢測農藥殘留，同時挺高了對目標分析物的選擇專一性和放大了檢測輸出信號。近年來，也有部分科研者在研究將分子印跡技術和螢光傳感器結合後，用於檢測農藥殘留。

2013年，中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所公布了發明專利（cn103558203）「磁性分子印跡聚合物-螢光分析方法」，報導了用磁性分子印跡仿生材料，替代了一般快速檢測方法中常用但難以製備的天然抗體，藉助農藥分子與螢光探針對磁性印跡聚合物的競爭，從技術上實現了三嗪類農藥的非免疫法快速檢測。而且發明的磁性印跡聚合物，有利於農藥分子的富集和分離。2015年，天津大學公布了發明專利（cn105092548）「一種基於分子印跡比率型螢光探針檢測對硝基苯酚的方法」，所述的螢光納米粒子是在其表面生長一層含有印跡分子硝基苯酚的二氧化矽層，得到分子印跡雙螢光複合納米粒子。在該結構中，位於二氧化矽納米粒子該內部的量子點作為參比螢光信號，外層分子印跡層中的碳點作為響應螢光信號，用於對硝基苯酚的選擇性識別。該方法克服了傳統單一螢光信號分析方法易受環境影響的缺點。2016年，江蘇大學博士衛瀟在畢業論文「cdte量子點分子印跡複合螢光傳感器的製備及其選擇性識別與螢光檢測性能研究」中，以硫代蘋果酸（msa）修飾的cdte量子點為螢光載體，aptes(3-氨丙基三乙氧基矽烷)為功能單體，teos(正矽酸乙酯)為交聯劑，氟氯氰菊酯（lc）為模板分子，用反相微乳法成功製備了量子點分子印跡螢光傳感器（cdte@sio2@mips）。利用tem、sem、ft-ir和分子螢光分光光度計等表徵手段研究了cdte@sio2@mips的形貌特徵、結構組成和光學性能。螢光檢測實驗證明了lc能夠使cdte@sio2@mip螢光發生猝滅，且在5.0~60μmol/l的濃度範圍內存在線性關係。選擇性識別實驗說明cdte@sio2@mip對lc有明顯的選擇性識別能力。最終所建立的分析方法成功應用於實際水體中lc濃度的檢測。

不過分子印跡螢光傳感器的研究仍處於初級階段，還存在許多問題需要解決，需要開發更多的分子印跡螢光傳感器製備方法和檢測體系，而且這一直會成為現代發展的主題。

螢光傳感器一般分為三類：有機染料螢光傳感器、稀土螢光傳感器和量子點螢光傳感器。有機螢光染料結構穩定，螢光量子產率較高，但有機螢光標記物激發光譜和發射光譜之間的stokes位移較小，進行螢光檢測時易受到激發光的幹擾，同時還易受到來自背景螢光、雜散光（tyndall，rayleigh，raman）等的嚴重影響。另外，極性、ph值、長時間激發照射、含氧水平和與其它重原子或吸收基團靠近等外界環境的變化都會引起螢光強度的變化，導致螢光淬滅或光漂白現象的發生（葉張梅，上海大學碩士學位論文，2011）。為了減少背景對有機染料的影響，會選擇一些性能好的材料對其進行包裹，如二氧化矽和二氧化鈦等，進而形成核殼結構。螢光染料分子被三維的二氧化矽網狀體系所包圍著，可以克服外界環境對螢光材料的影響，隔絕了外界氧氣或其它螢光淬滅物質對殼內螢光染料的影響，顯著提高了其光穩定性，明顯延長了螢光壽命。而且一個螢光納米顆粒內可包埋成千上萬個螢光分子，螢光標記信號顯著增強，檢測靈敏度明顯提高。

美國的一篇發明專利（us20100261244）「methodforimmobilizingbio-materialontitaniumdioxidenanoparticlesandtitaniumdioxidenanoparticlesimmobilizedbybio-material」，報導了一種將生物高反射材料固定在二氧化鈦納米顆粒表面的方法，目的是提高共振反射生物傳感器的靈敏度。二氧化鈦納米粒子因光學穩定、無毒和廉價等優點，廣泛應用於配製螢光探針（cn1707244a;cn105806923;cn102010712），結果表明，二氧化鈦容易成球，表面極易附著螢光前驅體，從而製備的核殼結構螢光納米微球性能優良。

在本發明中，我們報導了基於光誘導電子轉移原理在表面富含氨基的二氧化鈦納米粒子，實現對ddt的檢測。根據之前的闡述，可以看出二氧化鈦納米粒子非常適合製備成螢光探針，因為在可見光範圍內二氧化鈦納米粒子螢光探針光學透明，而且有光子物理惰性以及其表面能夠很容易通過與矽烷化試劑縮合反應而修飾上新組裝功能的亞單元。二氧化鈦納米粒子表面修飾的氨基能夠與ddt目標分子形成氫鍵，由於存在電子離域，這種電荷轉移複合物在532nm波長顯示了一個很強的可見吸收峰。這一結果的發現，激發我們在二氧化鈦納米粒子表面通過共價交聯3-氨丙基三乙氧基矽烷（3-aminopropyltriethoxysilane，apts）來探索基於光誘導電子轉移機理的化學傳感器對ddt目標分子高選擇性、高靈敏的檢測。選擇一個合適的螢光材料，其螢光發射光譜與apts-ddt複合物的紫外-可見的吸收光譜相重合，當它們在空間上相互接近時，螢光材料的螢光通過apts-ddt之間形成的氫鍵增強，抑制了螢光的淬滅。由於二氧化鈦納米粒子的表面有許多對ddt結合敏感性很強的氨基亞單元，所以製備成的螢光探針會選擇性的對環境中ddt目標分子形成快速的響應。這種表面修飾了apts的二氧化鈦納米粒子，通過光誘導電子轉移原理，在液相中能夠檢測到納摩爾濃度級的ddt。這種對ddt分子具有專識性作用的螢光二氧化鈦納米粒子，以螢光作為探針、氨基為識別位點，顯現出對ddt高選擇性、高靈敏和痕量的檢測。

另外，二氧化鈦具有優良的光催化性能，利用二氧化鈦的這個特性可以進一步將農藥ddt降解，變成無毒的二氧化碳、水分子和其他離子。二氧化鈦半導體的能帶是不連續的，是由價帶和導帶構成，這兩部分之間有一個能帶隙即禁帶，禁帶的寬度為3.2ev，所以當光照射在tio2晶粒表面時，會吸收波長≤387.5nm的近紫外光波，此時價帶中的電子就會被激發到導帶，同時在價帶上產生相應的空穴，形成了光生電子空穴對。電子和空穴在內部電場的作用下發生分離，並在催化劑表面向不同的方向遷移，進而在表面發生氧化還原反應。龔麗芬等研究表明，在日光燈照射30min後，光敏劑修飾摻雜鈰的ntio2對六六六、滴滴涕（ddd）、滴滴涕伊（dde）等有機氯農藥的光降解率達到85%以上。光照45min時，解率達95%以上（廈門大學學報，2008，7(1):79-82）。李梅金等以ticl4為原料，利用水解法製備了銳鈦礦型納米tio2。研究了α、β、γ、δ-六六六（bhc）、滴滴涕、狄氏劑、三氯殺蟎醇、七氯等含氯農藥在納米tio2的懸浮體系和紫外光作用下的降解行為。由於c-cl鍵能的關係，不同有機氯農藥的光降解效率有很大的不同，其中三氯殺蟎醇的降解率最高為70%，狄氏劑的降解率為45%，滴滴涕的為23%，七氯的降解率最低為14%。在4種bhc異構體中，α-bhc的轉化率最高，光照4h後已基本上降解完全，β-bhc的轉化率相對較低，有40%左右，降解率順序為α-bhc＞γ-bhc＞δ-bhc＞β-bhc（光譜學與光譜分析，2008，8(6):1364-1367）。從前人的研究可以看出，二氧化鈦催化劑降解ddt的效率比較低，所以，提高二氧化鈦催化降解ddt效率的研究還在繼續。

在本發明中，在可見光下，製備的二氧化鈦納米粒子螢光探針與目標分子ddt通過光誘導電子轉移原理進行識別檢測，檢測後載有ddt的螢光探針，在小於387.5nm波長下，螢光探針中的ddt因二氧化鈦的光催化作用被降解。目前，還未見在二氧化鈦殼層表面修飾上氨基，進而對ddt痕量檢測的報導，而且沒有相關文獻報導利用二氧化鈦納米粒子製備的螢光探針對ddt先檢測後降解的研究。所以合成高選擇性和高靈敏的二氧化鈦納米粒子螢光探針的製備方法，實現對ddt分子原位識別、檢測以及降解，有其必要性。

技術實現要素：

發明目的：針對目前現有技術存在的不足之處，以二氧化鈦為核，在其表面修飾上4-氯-7-硝基苯並呋喃螢光探針和氨丙基功能基團，最後在其表面印跡類目標分子，形成二氧化矽印跡殼層，得到核-層-殼型螢光探針粒子，發明了一種用於ddt檢測的帶有氨基的二氧化鈦納米粒子的製備方法，並首次將二氧化鈦納米粒子表面進行功能化修飾用於對痕量ddt分子的識別、檢測和降解。所述方法為化學合成法，運用溶膠-凝膠法合成具有納米尺度大小的ddt分子印跡聚合物微球。首先螢光劑4-氯-7-硝基苯並呋喃（4-chloro-7-nitrobenzofurazan，nbd-cl）和功能單體apts反應，得到nbd-apts複合物，即螢光前驅體；然後，4，4』-亞乙基雙苯酚（4，4』-ethylidenebisphenol，eda）（ddt類似物）作為模板分子，與3-異氰基丙基三乙氧基矽烷（icpts）反應，得到eda-icpts複合物。在無水乙醇中，氨水作為催化劑，正矽酸乙酯（tetraethoxysilane，teos）作為交聯劑，鈦酸丁酯水解得二氧化鈦微球，分別與上述兩種複合物反應，最終得到ddt分子印跡聚合物微球。

本發明的技術方案是：一種用於ddt檢測的tio2納米粒子螢光探針的製備方法，其特徵在於：所述二氧化鈦納米粒子螢光探針內部的印跡識別位點上的氨基可與進入識別位點的ddt分子相互作用，氨丙基上的氫原子與ddt分子上的氯原子形成氫鍵，使氨丙基穩定，光激發時，阻止氨丙基上氮原子的電子轉移到nbd-apts複合物，根據光誘導電子轉移機理，導致複合物螢光強度的增強，通過印跡位點的匹配和螢光強度的改變，實現對ddt分子的識別和檢測，其製備過程包括如下三個步驟：

1.1nbd-apts複合物的製備：首先，用電子天平準確稱量0.0010g~0.0030g4-氯-7-硝基苯並呋喃（4-chloro-7-nitrobenzofurazan，nbd-cl）置於50ml單頸磨口燒瓶中，然後，再用量程為100μl~1000μl的微量進樣器吸取220μl~230μl3-氨丙基三乙氧基矽烷（3-aminopropyltriethoxysilane，apts）加入到上述燒瓶中，最後，再向燒瓶中加入10ml~20ml乙醇，將燒瓶中混合物超聲分散4min~6min，在惰性氣氛中，以400rpm~600rpm攪拌速度在50℃下反應1h~3h；

1.2eda-icpts複合物的製備：首先用電子天平準確稱量0.4230g~0.4250g4，4』-亞乙基雙苯酚（4，4』-ethylidenebisphenol，eda）置於100ml單頸磨口燒瓶中，然後，再用量程為100μl~1000μl的微量進樣器吸取1000μl3-異氰丙基三乙氧基矽烷（3-isocyanatopropyltriethoxysilane，icpts）加入到上述燒瓶中，最後加入10ml~20ml乙醇，將上述100ml燒瓶中混合液超聲分散7min~9min，在惰性氣氛中，以400rpm~600rpm攪拌速度在50℃下反應5h~7h；

1.3表面修飾氨基和螢光基團的印跡類目標分子的二氧化鈦納米粒子的製備：分別量取60ml~80ml的乙醇溶液和2ml~4ml的鈦酸丁脂置於250ml燒瓶中超聲混合，然後再加入上述製備好的nbd-apts複合物溶液，在室溫下以450rpm~550rpm攪拌2min~4min，隨後再加入製備好的eda-icpts複合物溶液，最後，把500μl~1000μl氨水和440μl~460μl正矽酸乙酯（tetraethoxysilane，teos）加入到上述反應溶液中，以700rpm~800rpm攪拌3min後，攪拌轉速降至450rpm~550rpm，在室溫下反應24h，得到表面修飾氨基和螢光基團的印跡類ddt分子的二氧化鈦納米粒子，然後用乙醇與丙酮體積比（ml:ml）為4:1的50ml混合溶液洗脫類目標分子；

在90℃下，將上述洗脫類目標分子的二氧化鈦納米粒子在60ml的濃度為0.25mol/l的四氫鋁鋰的四氫呋喃溶液中回流2h，再用無水四氫呋喃清洗三次去除吸附在二氧化鈦納米粒子表面上多餘的四氫鋁鋰，得到含氨基、螢光基團對目標分子具有選擇識別、檢測的二氧化鈦納米粒子螢光探針。

作為對現有技術的進一步改進，所說螢光探針為二氧化鈦納米粒子，其表面包覆一薄層二氧化矽，其粒徑可以通過調節鈦酸丁酯的用量來加以控制；所說二氧化鈦納米粒子表面經修飾使其表面富含氨基；所說矽烷化試劑是3-異氰基丙基三乙氧基矽烷；所說被識別分子為ddt；所說二氧化鈦納米粒子表面的氨基能夠專識性的結合ddt目標分子，形成氫鍵化合物；所說二氧化鈦納米粒子表面殘基氨基能夠與ddt形成氫鍵，抑制電子轉移，使螢光增強；所說二氧化鈦納米粒子，在小於387.5nm波長下，能夠降解ddt。

相對於現有技術的有益效果：

近年來，國內對於檢測ddt的方法，常用的還是色譜法。採用氣相色譜法（gc）對金線蓮中bhc（α-bhc、β-bhc、γ-bhc、δ-bhc）、滴滴涕（pp′-dde、pp′-ddd、op′-ddt、pp′-ddt）8種有機氯類農藥殘留的限量檢測。得出結果：bhc、滴滴涕標準工作曲線的線性良好，相關係數0.9988~0.9997，平均收率95.4%~98.9%，sd為1.00%~2.98%。檢出限為0.0053~0.021μg/l。測定結果顯示：β-bhc為0.0009mg/kg（其中α-bhc、γ-bhc、δ-bhc、pp'-dde、op'-ddt、pp'-ddd、pp'-ddt未檢出）。得出結論該方法具有較高的靈敏度和線性範圍，測定結果準確可靠，科學可行，用於金線蓮中bhc和滴滴涕農藥殘留的質量監控（chinesetraditionalandherbaldrugs，2016,47,4082-4084）。採用乙腈提取，全自動固相萃取儀淨化，轉蒸發儀濃縮；經db-1701毛細管柱分離後進行質譜分析，用選擇性離子檢測模式，以子離子豐度比定性，標法定量。六六六與滴滴涕在4ppb~160ppb質量濃度範圍內線性關係良好（相關係數均大於0.99），法檢出限為0.10~2.15ppb。稻殼中六六六與滴滴涕的兩個添加水平的回收率在84.2%~109.7%，復性的相對標準偏差（rsd）在4.3%~7.4%之間。該方法準確可靠，用於稻殼中六六六與滴滴涕農藥殘留的定性定量分析（liquor-makingscience&technology，2016,9,79-82）。

但是之前討論過，色譜法雖然能夠滿足準確和定性定量的要求，但需要精密的設備和專業人員操作，耗時、費力，而且不能實時實地檢測。基於這些原因發展了其他檢測方法，而印跡分子螢光探針是研究熱點，還未見到在二氧化鈦表面修飾氨基和nbd-cl，結合印跡技術探測以及降解ddt的文獻。因此，合成高選擇性和高靈敏印跡分子螢光探針的製備方法，實現對ddt分子的原位識別、檢測和降解，有其必要性。

本發明首先是nbd-apts複合物和eda-icpts複合物的製備：用電子天平準確稱量0.0010g~0.0030gnbd-cl置於50ml單頸磨口燒瓶中，然後，用量程為100μl~1000μl的1000μl微量進樣器吸取220μl~230μlapts加入到上述燒瓶中，最後，再向燒瓶中加入10ml~20ml乙醇，將燒瓶中混合物超聲分散4min~6min，在惰性氣氛中，以400rpm~600rpm攪拌速度在50℃下反應1h~3h。同時用電子天平準確稱量0.4230g~0.4250geda置於100ml單頸磨口燒瓶中，然後，再用量程為100μl~1000μl的微量進樣器吸取1000μlicpts加入到上述燒瓶中，最後加入10ml~20ml乙醇，將上述100ml燒瓶中混合液超聲分散7min~9min，在惰性氣氛中，以400rpm~600rpm攪拌速度在50℃下反應5h~7h。

其次，表面修飾氨基和螢光基團的印跡類目標分子的二氧化鈦納米粒子的製備：分別量取60ml~80ml的乙醇溶液和2ml~4ml的鈦酸丁脂置於250ml燒瓶中，再加入上述製備好的nbd-apts複合物溶液，在室溫下以450rpm~550rpm攪拌2min~4min，然後再加入製備好的eda-icpts複合物溶液，再把500μl~1000μl氨水和440μl~460μlteos加入到上述反應溶液中，可見光下，以700rpm~800rpm攪拌3min後，攪拌轉速降至450rpm~550rpm，在室溫下反應24h，得到表面修飾氨基和螢光基團的印跡類ddt分子的二氧化鈦納米粒子，然後用乙醇與丙酮體積比（ml:ml）為4:1的50ml混合溶液洗脫類目標分子。

在90℃下，將上述洗脫類目標分子的二氧化鈦納米粒子在60ml的濃度為0.25mol/l的四氫鋁鋰的四氫呋喃溶液中回流2h，再用無水四氫呋喃清洗三次去除吸附在二氧化鈦納米粒子表面上多餘的四氫鋁鋰，得到含氨基、螢光基團對目標分子具有選擇識別、檢測的二氧化鈦納米粒子螢光探針。

綜上所述，表面修飾氨基的二氧化鈦納米粒子，尤其是在二氧化鈦納米粒子上包覆了一層二氧化矽，既增大螢光探針的比表面積，又增加了分子識別位點，提高了選擇性、識別性和敏感性。

其二：表面修飾了氨基的二氧化鈦納米粒子螢光探針，能夠對ddt分子選擇性識別。根據光誘導電子轉移機理來檢測ddt是否進入分子印跡聚合物識別位點，氨丙基上的氫原子與ddt分子上的氯原子形成氫鍵，使氨丙基穩定，光激發時，阻止氨丙基上氮原子的電子轉移到nbd-apts複合物，根據光誘導電子轉移機理，導致複合物螢光強度的增強。

其三：與傳統的稀土螢光材料相比較，表面修飾氨基的二氧化鈦納米粒子螢光探針具有較大的比表面積，擁有識別位點，提高了對目標分子選擇性識別，利用光誘導電子轉移原理，提高了對目標分析物的高敏感的檢測。

其四：本發明所提供的方法中，二氧化鈦納米粒子粒徑和厚度可控，可以通過調節鈦酸丁酯的用量來加以控制。

其五：選擇用二氧化鈦的原因，有以下幾點：（1）容易合成二氧化鈦溶膠，有較大的比表面積，需要相對較低的成本；（3）在反應過程中，具有化學和熱的穩定性，不與有機溶劑反應；（4）表面容易嫁接有機官能團；（5）對環境無害；（6）具有優良的光催化性能，當光能量大于禁帶寬度時，產生電子孔穴對，具備降解ddt的能力，將ddt降解為無毒的有機分子。

其六：首先ddt的類似物eda與icpts通過共價鍵的形式結合，然後與nbd-apts以非共價鍵（氫鍵）的形式結合，抑制了螢光淬滅，因此螢光增強。這種混合分子印跡技術彌補了共價鍵和非共價鍵分子印跡技術的缺點。

附圖說明

圖1是本發明所採用的表面富含氨基的二氧化鈦納米粒子螢光探針示意圖。

圖2是本發明所採用的表面富含氨基的二氧化鈦納米粒子螢光探針與ddt目標分子之間通過光誘導電子轉移原理實現對ddt高選擇性、高靈敏檢測示意圖。

圖3是本發明所採用的二氧化鈦納米粒子螢光探針掃描電子顯微鏡圖。

圖4是本發明所採用的二氧化鈦納米粒子螢光發射光譜圖及在365nm紫外燈下的光學照片。

圖5是本發明所採用的回流前後的表面修飾氨基和螢光基團的印跡類目標分子的二氧化鈦納米粒子的紅外譜圖。

圖6是本發明所採用的二氧化鈦納米粒子螢光探針接觸待測物質ddt後的螢光增強圖。

圖7是本發明所採用的ddt在印跡微球以及非印跡微球上的等溫吸附曲線圖。

圖8是本發明所採用的ddt分子印跡微球與非印跡微球的動力學吸附曲線圖。

根據附圖進一步解釋具體實施方式

圖1是本發明所採用的表面富含氨基的二氧化鈦納米粒子螢光探針示意圖。在圖1中，首先分別是nbd-apts複合物和eda-icpts複合物的製備：用電子天平準確稱量nbd-cl，置於單頸磨口燒瓶中，然後再吸取apts，加入到上述燒瓶中，最後，再向燒瓶中加入乙醇，將燒瓶中混合物超聲分散5min，在惰性氣氛中，以500rpm攪拌速度在50℃下反應2h。同時用電子天平準確稱量eda，置於單頸磨口燒瓶中，然後再吸取icpts，加入到上述燒瓶中，最後加入乙醇，將上述燒瓶中混合液超聲分散8min，在惰性氣氛中，以500rpm攪拌速度在50℃下反應6h。再是表面修飾氨基和螢光基團的印跡類目標分子的二氧化鈦納米粒子的製備：分別量取乙醇溶液和鈦酸丁脂置於250ml燒瓶中，再加入上述製備好的nbd-apts複合物溶液，在室溫下以500rpm攪拌3min（圖一中1-2步驟），然後再加入製備好的eda-icpts複合物溶液，再把氨水和teos加入到上述反應溶液中，可見光下，以800rpm攪拌3min後，攪拌轉速降至500rpm，在室溫下反應24h，得到表面修飾氨基和螢光基團的印跡類ddt分子的二氧化鈦納米粒子（圖一中2-3步驟），然後用乙醇與丙酮體積比（ml:ml）為4:1的50ml混合溶液洗脫類目標分子（圖一中3-4步驟）。

將上述製備的二氧化鈦納米粒子在含有四氫鋁鋰的四氫呋喃溶液中回流2h。最後將所得的溶液用無水四氫呋喃清洗三次去除吸附在表面二氧化鈦納米粒子上多餘的四氫鋁鋰，然後用無水乙醇清洗三次，去除吸附在表面二氧化鈦納米粒子上多餘的apts，得到表面富含氨基對ddt具有高選擇性、高靈敏性和痕量探測二氧化鈦納米粒子螢光探針。

圖2是本發明所採用的表面富含氨基的二氧化鈦納米粒子螢光探針與ddt目標分子之間通過光誘導電子轉移原理實現對ddt高選擇性、高靈敏檢測示意圖。ddt與聚合物微球氨基中的氫原子之間以氫鍵的作用力結合。ddt分子進入二氧化鈦納米粒子螢光探針內部的印跡識別位點，與氨丙基上的氫原子形成氫鍵，使氨丙基穩定，光激發時，阻止氨丙基上氮原子的電子轉移到nbd-apts複合物，根據光誘導電子轉移機理，導致複合物螢光強度的增強，通過印跡位點的匹配和螢光強度的改變，實現對ddt分子的識別。

圖3是本發明所採用的二氧化鈦納米粒子螢光探針掃描電子顯微鏡圖。本實驗中採用溶膠-凝膠合成法合成二氧化鈦納米粒子螢光探針，通過sem圖可以看到核-層-殼結構的二氧化鈦納米粒子呈球狀，粒徑均勻，粒徑在200nm左右，表面緻密均勻。

圖4是本發明所採用的二氧化鈦納米粒子的螢光發射光譜圖及在365nm紫外燈下的光學照片。由圖可以看出二氧化鈦納米粒子在460nm的發射波激發下，在532nm的地方出現了吸收峰，說明二氧化鈦粒子螢光為綠色，將二氧化鈦納米粒子放在365nm的紫外燈下，可以看到，確實為綠色。

圖5是本發明所採用的回流前後的表面修飾氨基和螢光基團的印跡類目標分子的二氧化鈦納米粒子的紅外譜圖。圖中可以明顯發現，在1620cm-1處，氨基的彎曲振動峰在回流前後明顯不同，回流前的黑色線中，氨基峰並不十分明顯，幾乎沒有，而回流後的紅色線中的氨基峰則大大增強。說明回流使得二氧化鈦納米粒子中的氨基大大增多，達到了洗脫模板分子的目的。

圖6是本發明所採用的二氧化鈦納米粒子螢光探針接觸待測物質ddt後的螢光增強圖。採用逐步稀釋的方法，將待測目標分子ddt配製成濃度為1´10-9~1´10-5mol∙l-1，從低濃度開始逐步加入到比色皿中，每次用移液槍移取20μl，加入裝有2ml的比色皿後，搖晃均勻，進行螢光檢測。圖中可以明顯發現，納米粒子在激發波長460nm下，隨著ddt濃度的增加，發生螢光增強現象。

圖7是本發明所採用的ddt在印跡微球以及非印跡微球上的等溫吸附曲線圖。在ddt濃度為1.0´10-5~11.0´10-5mol∙l-1的乙醇溶液的濃度範圍內，測定ddt在不同印跡和非印跡材料上的平衡結合量。圖中可以發現ddt在印跡聚合物微球上的最大平衡吸附約為非印跡聚合物微球最大平衡吸附量的3倍，這說明ddt分子印跡聚合物微球對ddt有較好的親合力，這主要是由於在製備ddt印跡聚合物微球時，在聚合物中形成了與ddt分子形狀相匹配、大小合適和能相互作用的功能基團的孔穴，從而使印跡分子能夠很好的進入結合位點，產生較高的結合量。

圖8是本發明所採用的ddt分子印跡微球與非印跡微球的動力學吸附曲線圖。在10ml濃度為5.0×10-5mol∙l-1的ddt乙醇溶液中準確加入印跡聚合物微球10mg，測定不同時間印跡聚合物微球對ddt的吸附量，選取非納米印跡聚合物測定不同時間對ddt的吸附量作為對比實驗。圖中可以看出ddt印跡的納米結構微球和非納米印跡結構微球隨時間變化的ddt結合量變化曲線圖在達到平衡吸附量之前，分子印跡聚合物納米微球從溶液相中吸附ddt分子的速率遠遠大於非納米結構的印跡二氧化鈦聚合物，而且分子印跡聚合物納米微球在溶液相中的吸附達到最大平衡吸附量的50％所需要的時間約為50min，達到最大平衡吸附量的時間約為120min，而常規印跡微球在溶液中的吸附達到最大平衡吸附量的50％的時間約為130min，達到最大平衡吸附量的時間長達360min。

具體實施方式

一種用於ddt檢測的二氧化鈦納米粒子螢光探針的製備方法，其特徵在於：所述二氧化鈦納米粒子螢光探針內部的印跡識別位點上的氨丙基可與進入識別位點的ddt分子相互作用，氨丙基上的氫原子與ddt分子上的氯原子形成氫鍵，使氨丙基穩定，光激發時，阻止氨丙基上氮原子的電子轉移到nbd-apts複合物，根據光誘導電子轉移機理，導致複合物螢光強度的增強，通過印跡位點的匹配和螢光強度的改變，實現對ddt分子的識別和檢測，其製備過程包括如下三個步驟：

1.1nbd-apts複合物的製備：首先，用電子天平準確稱量0.0010g~0.0030g4-氯-7-硝基苯並呋喃（4-chloro-7-nitrobenzofurazan，nbd-cl）置於50ml單頸磨口燒瓶中，然後，再用量程為100μl~1000μl的微量進樣器吸取220μl~230μl3-氨丙基三乙氧基矽烷（3-aminopropyltriethoxysilane，apts）加入到上述燒瓶中，最後，再向燒瓶中加入10ml~20ml乙醇，將燒瓶中混合物超聲分散4min~6min，在惰性氣氛中，以400rpm~600rpm攪拌速度在50℃下反應1h~3h；

1.2eda-icpts複合物的製備：首先用電子天平準確稱量0.4230g~0.4250g4，4』-亞乙基雙苯酚（4，4』-ethylidenebisphenol，eda）置於100ml單頸磨口燒瓶中，然後，再用量程為100μl~1000μl的微量進樣器吸取1000μl3-異氰丙基三乙氧基矽烷（3-isocyanatopropyltriethoxysilane，icpts）加入到上述燒瓶中，最後加入10ml~20ml乙醇，將上述100ml燒瓶中混合液超聲分散7min~9min，在惰性氣氛中，以400rpm~600rpm攪拌速度在50℃下反應5h~7h；

1.3表面修飾氨基和螢光基團的印跡類目標分子的二氧化鈦納米粒子的製備：分別量取60ml~80ml的乙醇溶液和2ml~4ml的鈦酸丁脂置於250ml燒瓶中超聲混合，然後再加入上述製備好的nbd-apts複合物溶液，在室溫下以450rpm~550rpm攪拌2min~4min，隨後再加入製備好的eda-icpts複合物溶液，最後，把500μl~1000μl氨水和440μl~460μl正矽酸乙酯（tetraethoxysilane，teos）加入到上述反應溶液中，以700rpm~800rpm攪拌3min後，攪拌轉速降至450rpm~550rpm，在室溫下反應24h，得到表面修飾氨基和螢光基團的印跡類ddt分子的二氧化鈦納米粒子，然後用乙醇與丙酮體積比（ml:ml）為4:1的50ml混合溶液洗脫類目標分子；

在90℃下，將上述洗脫類目標分子的二氧化鈦納米粒子在60ml的濃度為0.25mol/l的四氫鋁鋰的四氫呋喃溶液中回流2h，再用無水四氫呋喃清洗三次去除吸附在二氧化鈦納米粒子表面上多餘的四氫鋁鋰，得到含氨基、螢光基團對目標分子具有選擇識別、檢測的二氧化鈦納米粒子螢光探針。

在表面修飾氨基的二氧化鈦納米粒子螢光探針中加入目標分子，能夠改變其識別性能。如加入ddt分子，二氧化鈦納米螢光探針表面的氨基與ddt分子苯環上的氯原子形成氫鍵，阻止富含電子的氨基上的電子向nbd-cl轉移，抑制了螢光淬滅，致使螢光增強，從而得到對ddt分子的識別和檢測。

實施例：首先根據共價耦聯反應，製得nbd-apts複合物，然後根據非共價鍵（氫鍵）反應和交聯反應可得到表面富含氨基的二氧化鈦納米粒子螢光探針。

第一步是nbd-apts複合物的製備：首先，用電子天平準確稱量0.0016g4-氯-7-硝基苯並呋喃（4-chloro-7-nitrobenzofurazan，nbd-cl）置於50ml單頸磨口燒瓶中，然後，再用量程為100μl~1000μl的微量進樣器吸取220μl3-氨丙基三乙氧基矽烷（3-aminopropyltriethoxysilane，apts）加入到上述燒瓶中，最後，再向燒瓶中加入16ml乙醇，將燒瓶中混合物超聲分散5min，在惰性氣氛中，以500rpm攪拌速度在50℃下反應2h；

第二步是eda-icpts複合物的製備：首先用電子天平準確稱量0.4240g4，4』-亞乙基雙苯酚（4，4』-ethylidenebisphenol，eda）置於100ml單頸磨口燒瓶中，然後，再用量程為100μl~1000μl的微量進樣器吸取1000μl3-異氰丙基三乙氧基矽烷（3-isocyanatopropyltriethoxysilane，icpts）加入到上述燒瓶中，最後加入16ml乙醇，將上述100ml燒瓶中混合液超聲分散8min，在惰性氣氛中，以500rpm攪拌速度在50℃下反應6h；

第三步是表面修飾氨基和螢光基團的印跡類目標分子的二氧化鈦納米粒子的製備：分別量取70ml的乙醇溶液和3ml的鈦酸丁脂置於250ml燒瓶中超聲混合，然後再加入上述製備好的nbd-apts複合物溶液，在室溫下以500rpm攪拌3min，隨後再加入製備好的eda-icpts複合物溶液，最後，把800μl氨水和440μl正矽酸乙酯（tetraethoxysilane，teos）加入到上述反應溶液中，以800rpm攪拌3min後，攪拌轉速降至500rpm，在室溫下反應24h，得到表面修飾氨基和螢光基團的印跡類ddt分子的二氧化鈦納米粒子，然後用乙醇與丙酮體積比（ml:ml）為4:1的50ml混合溶液洗脫類目標分子；

在90℃下將上述洗脫類目標分子的二氧化鈦納米粒子在60ml的濃度為0.25mol/l的四氫鋁鋰的四氫呋喃溶液中回流2h，再用無水四氫呋喃清洗三次去除吸附在二氧化鈦納米粒子表面上多餘的四氫鋁鋰，得到含氨基、螢光基團對目標分子具有選擇性、檢測性的二氧化鈦納米粒子螢光探針。