花鱸凝集素基因序列的製作方法
2023-05-04 08:04:56 4
專利名稱：花鱸凝集素基因序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學中基因領域，特別是關於花鱸凝集素的基因。
背景技術：
凝集素是一種非免疫來源的能凝集細胞或沉澱含糖大分子的蛋白質或糖蛋白，一般具有糖結合專一性，能與糖蛋白或糖脂的糖相結合，其功能涉及細胞生長、分化、發育和免疫等，特別是在凝集外來細胞，參與吞噬、包囊、凝固、止血及創傷修復等方面發揮著重要的作用。
隨著海水養殖業的發展，病害問題日趨嚴重，一般的抗生素藥物極易引起環境汙染，因此從魚體自身入手，提高魚體免疫力是病害防治的趨勢。非特異性防禦機制在水生動物防止感染中扮演重要角色，潛在的非特異性防禦機制可以在微生物入侵時發生作用，能更有效地清除、降解病原微生物和其它有害物質。大量研究表明，水生動物非特異性免疫系統在其自身抗病作用中較特異性免疫系統發揮更大作用。
發明內容
本發明的目的是通過以近源物種凝集素的基因的CDS序列的保守區設計的兼併引物，並用PCR法擴增，結合RACE技術克隆到花鱸凝集素的基因的全表達序列。該基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述；它的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
本發明的目的通過以下技術措施實現1、總RNA的提取解剖魚體取出脾臟，使用Trizol進行勻漿，按照使用說明提取花鱸總RNA。
2、cDNA第一鏈的合成花鱸總RNA與反轉錄引物(oligo-dT接頭引物)混合，進行反轉錄。
3、引物設計依據，引物合成的方法從GenBank中下載近源物種(如人、牛、虹鱒、牙鮃、鯉魚等)凝集素同源基因CDS序列，利用Clustal W軟體進行多序列比對，確定保守區，根據保守區序列設計兼併引物，擴增片段大小約為260bp。引物設計後採用β-乙睛亞磷醯胺化學法進行DNA合成。
醯胺化學法進行DNA合成。
引物序列為F5』GCAHATCCACATAGYCAACTC 3』R5』CGAAYCTCCGCCATCG 3』4、凝集素基因PCR擴增、克隆以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，用兼併引物進行PCR擴增，所擴增的PCR產物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從凝膠中純化回收目的產物。然後將純化的PCR產物克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌JM-109感受態細胞，挑取陽性克隆，提取質粒DNA。經簡併引物PCR檢測後，將具有插入片段的質粒DNA用M13通用引物進行雙向測序。
根據已得到的cDNA片段序列設計特異性引物，利用cDNA末端快速擴增技術(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)對目的基因的3′和5′末端進行PCR擴增。
在3′RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外側引物和接頭引物進行PCR反應，所得產物利用內側和接頭引物再進行PCR擴增。
在5′RACE中，利用末端轉移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾後，以加尾後的cDNA作為模板，利用外側特異性引物和OligodG進行第一次PCR擴增，所得PCR產物再利用內側引物和OligodG進行第二次PCR擴增。
所得到的PCR產物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測後，將PCR產物純化後，克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌JM-109感受態細胞，挑取陽性克隆，用M13引物對質粒DNA進行測序，測序所得序列再與兼併引物擴增所得的序列利用Clustal W軟體進行拼接。
5、對花鱸凝集素的基因的測定所得到的PCR產物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測後，將PCR產物純化後，克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌JM-109感受態細胞，挑取陽性克隆，用3730測序儀對質粒DNA進行測序。測序結果用BLAST軟體進行同源性測定，來確定為花鱸凝集素基因同源序列。比對結果為Sequences producing significant alignments (Bits) Valuegi|78191594|gb|ABB29992.1|FBP32II precursor[Morone chrysoos]4743e-132gi|78191592|gb|ABB29991.1|FBP32II precursor[Morone saxatilis]4743e-132gi|78191604|gb|ABB29997.1|FBP32[Morone saxatilis]4512e-125gi|78191588|gb|ABB29989.1|FBP32 precursor[Morone saxatitis]4512e-125
gi|78191590|gb|ABB29990.1|FBP32 precursor[Morone chrysops]4495e-125gi|78191607|gb|ABB29999.1|FBP32[Morone chrysops]4281e-118本發明的優點本基因的獲得不僅為研究魚類凝集素在炎症反應中的作用，為進一步探討魚類炎症反應的發生機理奠定基礎，而且通過基因序列可以獲得具有生物活性的純化蛋白，為研究新型的抗病免疫佐劑提供理論基礎。
具體實施例方式
1.總RNA的提取取鮮活健康花鱸(體重約400g)在實驗室內暫養2d後(水溫約24℃，氣泵充氣)，從胸腔注射脂多糖(LPS，10μg/mL)200μL。刺激6h後，解剖魚體取出脾臟約100mg，分別放入1mL Trizol(Gibco，Japan)中進行勻漿，按照試劑盒使用說明提取總RNA。
2.cDNA第一鏈的合成取花鱸總RNA 5μg與反轉錄引物(oligo-dT接頭引物)1μL(10pmol/L)混合，70℃加熱5min後，立即放置冰上，然後加入5×buffer，2.5mmol/L dNTP混合液，Ribonuclease Inhibitor，M-MLV反轉錄酶，反應體系為25μL。反應過程為42℃60min，70℃15min，最後放入-80℃保存備用。
3.引物設計依據，引物合成的方法從GenBank中下載近源物種(如人、牛、虹鱒、牙鮃、鯉魚等)凝集素同源基因CDS序列，利用Clustal W軟體進行多序列比對，確定保守區，根據保守區序列設計兼併引物，擴增片段大小約為260bp。引物設計後採用β-乙睛亞磷醯胺化學法進行DNA合成。
引物序列為F5』GCAHATCCACATAGYCAACTC 3』R5』CGAAYCTCCGCCATCG 3』4.凝集素基因cDNA全序列的克隆以近源物種凝集素基因CDS序列的保守區設計的兼併引物，擴增片段大小約為260bp。
以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，用兼併引物進行PCR擴增，反應體系為10xPCR反應緩衝液5μL，25mmol/L MgCl23μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，10nmol/L引物dTF和dTR各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水將反應體系補充至50μL。反應條件為1個循環，94℃變性5min；35個循環94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s；1個循環，72℃延伸10min；4℃保溫。所擴增的PCR產物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從凝膠中純化回收目的產物。然後將純化的PCR產物克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌JM-109感受態細胞，挑取陽性克隆，提取質粒DNA。經簡併引物PCR檢測後，將具有插入片段的質粒DNA用M13通用引物進行雙向測序。
根據已得到的cDNA片段序列設計特異性引物。利用cDNA末端快速擴增技術(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)對目的基因的3′和5′末端進行PCR擴增。
在3′RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外側引物和接頭引物進行PCR反應，所得產物稀釋50倍後，取1μL作為模板，利用內側和接頭引物再進行PCR擴增。
在5′RACE中，利用末端轉移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾後，以加尾後的cDNA作為模板，利用外側特異性引物和OligodG進行第一次PCR擴增，所得PCR產物取1μL作為模板，再利用內側引物和OligodG進行第二次PCR擴增。
所得到的PCR產物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測後，將PCR產物純化後，克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌JM-109感受態細胞，挑取陽性克隆，用M13引物對質粒DNA進行測序，測序所得序列再與兼併引物擴增所得的序列利用Clustal W軟體進行拼接。
5.對花鱸凝集素基因的測定所得到的PCR產物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測後，將PCR產物純化後，克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌JM-109感受態細胞，挑取陽性克隆，用3730測序儀對質粒DNA進行測序。測序結果用BLAST軟體進行同源性測定，來確定為花鱸凝集素基因同源序列。比對結果Sequences producing significant alignments(Bits) Valuegi|78191594|gb|ABB29992.1|FBP32II precursor[Morone chrysops]4743e-132gi|78191592|gb|ABB29991.1|FBP32II precursor[Morone saxatilis]4743e-132gi|78191604|gb|ABB29997.1|FBP32[Morone saxatilis]4512e-125gi|78191588|gb|ABB29989.1|FBP32 precursor[Morone saxatilis]4512e-125gi|78191590|gb|ABB29990.1|FBP32 precursor[Morone chrysops]4495e-125gi|78191607|gb|ABB29999.1|FBP32[Morone chrysops]4281e-118
序列表110中國水產科學研究院南海水產研究所120花鱸凝集素基因序列160221012111304212RNA213花鱸(Lateolabrax Japonicus)220
2213』UTP222(973)...(1304)220
2215』UTP222(1)...(39)220
221CDS222(40)...(972)220
221PolyA site222(1283)...(1304)220
221PolyA signal222(1263)...(1267)4001acattgagtc atccgtctcc aggaagaaag cagtccaga atg atg aga ctc agt 54Met Met Arg Leu Ser15gtt ttc ctt gtg ctc ctc ctc tcg gag acg tgc tca gct tcc act tat102Val Phe Leu Val Leu Leu Leu Ser Glu Thr Cys Ser Ala Ser Thr Tyr6 12 18gaa aat gtg gcc ttg cgt gga aaa gcg acc cag tcg agc cgt tat ttg150Glu Asn Val Ala Leu Arg Gly Lys Ala Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu22 28 34cat gcg ttt gga ggt gcc tac aat gct att gat gga aac aga gag tct198His Ala Phe Gly Gly Ala Tyr Asn Ala Ile Asp Gly Asn Arg Glu Ser38 44 50
cac ttc cac tct gga tca tgc acc cac tct gct gaa gag acc acc ccc246His Phe His Ser Gly Ser Cys Thr His Ser Ala Glu Glu Thr Asn Pro54 60 66tgg tgg aga gtg gac ctg ctg gac tcc tat gtc gtc acc tcc atc acc294Trp Trp Arg Val Asp Leu Leu Asp Ser Tyr Val Val Thr Ser Ile Thr70 76 82atc acc acc aga ggg gac tgc tgt gaa caa agg atc agc ggg ctg cag342Ieu Thr Asn Arg Gly Asp Cys Cys Glu Gln Arg Ile Ser Gly Leu Glu86 92 98atc cac ata ggc aac tct tta aag gac aac ggt gcc agt aac cca atg390Ile His Ile Gly Asn Ser Leu Lys Asp Asn Gly Ala Ser Asn Pro Met102 108 114gtt ggc aca atc tct gaa att ggt gca gct aag tcg ttc tct ctg cct438Val Gly Thr Ile Ser Glu Ile Gly Ala Ala Lys Ser Phe Ser Leu Pro118 124 130ttc acc gat cgt gtg gag gga cgc tat gtg act ttg gtt ctg cct ggt486Phe Thr Asp Arg Val Glu Gly Arg Tyr Val Thr Leu Val Leu Pro Gly134 140 146tca gga aag tac ctc aca ctc tgc gaa gtg gag gtc tat ggg tac cgt534Ser Gly Lys Tyr Leu Thr Leu Cys Glu Val Glu Val Tyr Gly Tyr Arg150 156 162gcc cca act gga gag aac ctg gcc atc caa gga aaa gcc aca cag tcc582Ala Pro Thr Gly Glu Asn Leu Ala Ile Glu Gly Lys Ala Thr Gln Ser166 172 178tca ttg ttt caa ttt ggc act gca tat aat gcc att gac ggg aat cat630Ser Leu Phe Glu Phe Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Ile Asp Gly Asn His182 188 194gcc agc aag tgg gaa gac ggc tcc tgt agt cac aca ata aac aac gtc678Ala Ser Lys Trp Glu Asp Gly Ser Cys Ser His Thr Ile Asn Asn Val198 204 210
aac ccc tgg tgg cga ttg gat ctg ggc aaa acc cat aaa gtg ttt tct 726Asn Pro Trp Trp Arg Leu Asp Leu Gly Lys Thr His Lys Val Phe Ser214 220 226gtt aag ata acc aac aca gat gaa aac cca gaa cga ctc gat gga gcg 774Val Lys Ile Thr Asn Thr Asp Glu Asn Pro Glu Arg Leu Asp Gly Ala230 236 242gag att cga atc gga gat tct ctt gaa aca atg gca aca cac ata cca 822Glu Ile Arg Ile Gly Asp Ser Leu Glu Thr Met Ala Thr Thr Ile Pro246 252 258cat gtg ctg tgg atc aca aat atc ccc ggc ggt gct gtt gaa ttc cag 870His Val Leu Trp Ile Thr Asn Ile Pro Gly Gly Ala Val Glu Phe Gln262268 274tgt aac ggg atg gac ggc cgc tac gtt acc gta gtc atc cca gga aga 918Cys Asn Gly Met Asp Gly Arg Tyr Val Thr Val Val Ile Pro Gly Arg278 284 290gaa gag ttc ctg aca ctt tgt gag gtg gag gtg tat ggc tcc aga ctg 966Glu Glu Phe Leu Thr Leu Cys Glu Val Glu Val Tyr Gly Ser Arg Leu294 300 306gattag 972Asp310gtctgaagaa gttcaaaatg cataagaaca tttggctttt actaactact catacaactg1032gaattacaac ttaagcttca atatagtccg aaaaaaagca tccaaaatca ttcctcgtga1092atcctagtat gacagtaatt gcattgtggg atttttttac ggaactattt agtgcataaa1152tataatcttt agccatgttt tgatttctaa tgcttttgtt gtattttctt ttttaatact1212aaacttttgt tgtactgtaa ccaacgtctt cagctgaaaa actgaaatac aataaaatca1272ttgcaaaacc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa2102211310212PRT213花鱸(Lateolabrax Japonicus)
4002Met Met Arg Leu Ser Val Phe Leu Val Leu Leu Leu Ser Glu Thr Cys1 7 13Ser Ala Ser Thr Tyr Glu Asn Val Ala Leu Arg Gly Lys Ala Thr Gln17 23 29Ser Ser Arg Tyr Leu His Ala Phe Gly Gly Ala Tyr Asn Ala Ile Asp33 39 45Gly Asn Arg Glu Ser His Phe His Ser Gly Ser Cys Thr His Ser Ala49 55 61Glu Glu Thr Asn Pro Trp Trp Arg Val Asp Leu Leu Asp Ser Tyr Val65 71 77Val Thr Ser Ile Thr Ieu Thr Asn Arg Gly Asp Cys Cys Glu Gln Arg81 87 93Ile Ser Gly Leu Glu le His Ile Gly Asn Ser Leu Lys Asp Asn Gly97 103 109Ala Ser Asn Pro Met Val Gly Thr Ile Ser Glu Ile Gly Ala Ala Lys113 119 125Ser Phe Ser Leu Pro Phe Thr Asp Arg Val Glu Gly Arg Tyr Val Thr129 135 141Leu Val Leu Pro Gly Ser Gly Lys Tyr Leu Thr Leu Cys Glu Val Glu145 151 157Val Tyr Gly Tyr Arg Ala Pro Thr Gly Glu Asn Leu Ala Ile Glu Gly161 167 173Lys Ala Thr Gln Ser Ser Leu Phe Glu Phe Gly Thr Ala Tyr Asn Ala177 183 189Ile Asp Gly Asn His Ala Ser Lys Trp Glu Asp Gly Ser Cys Ser His193 199 205Thr Ile Asn Asn Val Asn Pro Trp Trp Arg Leu Asp Leu Gly Lys Thr209 215 221His Lys Val Phe Ser Val Lys Ile Thr Asn Thr Asp Glu Asn Pro Glu225 231 237Arg Leu Asp Gly Ala Glu Ile Arg Ile Gly Asp Ser Leu Glu Thr Met241 247 253Ala Thr Thr Ile Pro His Val Leu Trp Ile Thr Asn Ile Pro Gly Gly257 263 269Ala Val Glu Phe Gln Cys Asn Gly Met Asp Gly Arg Tyr Val Thr Val273 279 285Val Ile Pro Gly Arg Glu Glu Phe Leu Thr Leu Cys Glu Val Glu Val289 295 301Tyr Gly Ser Arg Leu Asp305 310
權利要求
1.一種花鱸凝集素基因，它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
2.一種花鱸凝集素基因，它的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
全文摘要
本發明以近源物種凝集素同源基因CDS序列的保守區設計兼併引物，從花鱸魚的脾臟中提取總RNA，用PCR法擴增，結合RACE技術克隆到花鱸凝集素基因的全表達序列。該基因不僅為研究魚類凝集素在炎症反應中的作用，為進一步探討魚類炎症反應的發生機理奠定基礎，而且通過基因序列可以獲得具有生物活性的純化蛋白，為研究新型的抗病免疫佐劑提供理論基礎。
文檔編號C07K14/435GK1869226SQ20061003546
公開日2006年11月29日 申請日期2006年5月15日 優先權日2006年5月15日
發明者江世貴, 邱麗華, 張漢華 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所