共價疏水修飾的聚乙烯亞胺及其製備方法和應用的製作方法
2023-05-14 03:33:21
共價疏水修飾的聚乙烯亞胺及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於生物醫藥【技術領域】，涉及共價疏水修飾的聚乙烯亞胺及其製備方法和應用。本發明對轉染試劑聚乙烯亞胺進行疏水性共價修飾，改變該陽離子聚合物的部分理化性質，製得共價疏水修飾的聚乙烯亞胺；該共價疏水修飾的聚乙烯亞胺具有式（Ⅰ）的結構。經測試結果表明，所述共價疏水修飾的聚乙烯亞胺對核酸的轉染效率較未修飾的聚乙烯亞胺明顯提高；其可製備轉染試劑，用於動物或者人體水平的轉基因動物或者基因治療，或用於細胞水平的核酸轉染。（Ⅰ）
【專利說明】共價疏水修飾的聚乙烯亞胺及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物醫藥【技術領域】，涉及共價疏水修飾的聚乙烯亞胺及其製備方法和 應用；尤其涉及共價疏水修飾的聚乙烯亞胺在核酸轉染中的應用。
【背景技術】
[0002] 目前，基因治療、轉基因動物操作中，重要的環節是將基因轉入真核細胞，而將基 因轉入真核細胞的技術可歸納為三種：（1)生化方法轉染；（2)物理方法轉染；（3)病毒介 導的轉化。所述的生化方法轉染中常用的生化試劑有：磷酸鈣，二乙氨乙基-葡聚糖，陽離 子脂質體和陽離子聚合物。已知聚乙烯亞胺（polylethyleneimine, PEI)是最常用的陽離 子聚合物轉染試劑(美國專利6013240);其作用機理推測為帶負電荷的核酸和PEI靜電吸 附形成PEI-DNA (PEI-RNA)複合物，然後該複合物和帶負電荷的細胞膜靜電吸附，再後通 過胞吞作用轉入真核細胞內。美國專利6013240公開了陽離子聚合物PEI和陽離子脂質體 DOGS或DOPE能夠協同作用提高轉染效率；但實際使用中，仍發現其存在轉染效率不高的缺 陷，尚需對其進行改進。
[0003] 因此，本發明的 申請人:擬提供一種共價疏水修飾的聚乙烯亞胺；其與細胞膜不僅 有靜電吸附作用，還有疏水相互作用，使轉染複合物更容易進入真核細胞內。迄今為止，尚 未見有關共價疏水修飾的聚乙烯亞胺及其製備方法的報導。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種共價疏水修飾的聚乙烯亞胺及其製備方法和應用；尤其 涉及該共價疏水修飾的聚乙烯亞胺在核酸轉染中的應用；所述共價修飾的聚乙烯亞胺能提 高轉染效率，可用於細胞核酸轉染、轉基因動物、基因治療等。
[0005] 本發明中，利用有機化學手段對聚乙烯亞胺進行修飾，使其帶有一定的疏水性，同 時在水溶液(或者PBS，DMEM培養基）中可溶或者部分可溶；經測試結果顯示，修飾後的聚乙 烯亞胺較未修飾的聚乙烯亞胺對真核細胞的轉染效率有顯著提高，所述疏水修飾後的聚乙 烯亞胺與細胞膜不僅有靜電吸附作用，還有疏水相互作用，使轉染複合物更容易進入真核 細胞內。
[0006] 具體而言，本發明的共價疏水修飾的聚乙烯亞胺，對轉染試劑聚乙烯亞胺（美國專 利6013240)進行疏水性共價修飾，改變其中的陽離子聚合物的部分理化性質；該共價疏水 修飾的聚乙烯亞胺的結構式如式（I )所示，
【權利要求】
1. 一種共價疏水修飾的聚乙烯亞胺，其結構式如式（I )所示，
(I) 其中， 修飾基團為長度在1-20之間的直鏈或者支鏈烴基，選自飽和烴基、不飽和烴基、或其 他形式的疏水性的集團； 修飾方式選自氨基和羧基之間的縮合反應、或其他方式的共價修飾； 修飾位點為聚乙烯亞胺上的氨基、或碳原子； 共價修飾的烴基和聚乙烯亞胺單體的摩爾比為1:20(Tl: 1。
2. 按權利要求1所述的共價疏水修飾的聚乙烯亞胺，其特徵在於，所述共價修飾的烴 基和聚乙烯亞胺單體的摩爾比為l:2(Tl:5。
3. 按權利要求1所述的共價疏水修飾的聚乙烯亞胺，其特徵在於，所述共價疏水修飾 的聚乙烯亞胺其分子量為15_180kD。
4. 按權利要求1所述的共價疏水修飾的聚乙烯亞胺，其特徵在於，所述聚乙烯亞胺選 自支鏈聚乙烯亞胺，或支鏈聚乙烯亞胺。
5. 按權利要求1所述的共價疏水修飾的聚乙烯亞胺，其特徵在於，所述其他形式的疏 水性的集團是膽固醇。
6. 製備權利要求1的共價疏水修飾的聚乙烯亞胺的方法，其特徵在於，其包括步驟： (1) 共價修飾聚乙烯亞胺 聚乙烯亞胺溶於乙醇，油酸或者其他形式的脂肪酸或者膽酸溶於乙醇，添加羰基二咪 唑（CDI)，室溫反應兩個小時，製得共價疏水修飾的聚乙烯亞胺； (2) 純化修飾後的聚乙烯亞胺 將上述反應產物用10倍體積甲苯稀釋，冰上放置2h，抽濾，用冰冷甲苯洗兩遍，收集洗 滌後的固體，冷凍乾燥； (3) 配置修飾後聚乙烯亞胺溶液 用雙蒸水或者PBS溶液或者TBS溶液溶解修飾後的聚乙烯亞胺，配成濃度為lmg/ml的 儲液，製得共價疏水修飾的聚乙烯亞胺溶液。
7. 按權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述步驟（3)中，還包括用稀鹽酸降低溶液 的pH值。
8. 權利要求1所述的共價疏水修飾的聚乙烯亞胺在製備轉染核酸的試劑中的應用。
9. 按權利要求7所述的應用，其特徵在於，所述核酸選自DNA或RNA。
10. 按權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述DNA或RNA的形式為環形、線形或發卡 結構。
【文檔編號】C12N15/87GK104109241SQ201310133707
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2013年4月17日 優先權日:2013年4月17日
【發明者】虞先濬, 秦毅, 徐近, 張波, 倪泉興, 龍江, 劉辰, 劉亮, 許文彥, 吉順榮 申請人:復旦大學附屬腫瘤醫院