利用聚集誘導發光監測β澱粉樣蛋白聚集過程的方法
2023-05-13 21:01:56 3
專利名稱：利用聚集誘導發光監測β澱粉樣蛋白聚集過程的方法
技術領域：
本發明涉及β澱粉樣蛋白聚集過程的監測方法，尤其涉及利用聚集誘導發光法監測β澱粉樣蛋白聚集過程的方法，屬於生物醫學研究和臨床檢測技術領域。
背景技術：
阿爾茲海默氏病(Alzheimer』 s Disease, AD)是引起老年性痴呆最常見的一種疾病。目前，AD是老年人群中繼心腦血管病、癌症、中風之後的第四大殺手。AD的病理學特徵是在患者的大腦中可以觀察到細胞外衰老斑塊和細胞內的神經元纖維纏結，這是因為 β-澱粉樣蛋白(amyloid β -protein, A β )在細胞內外異常聚結可以形成對神經元細胞具有毒害作用的短肽聚集體。在血漿、腦脊髓液和短肽聚集體中最常見的Aβ是Αβ 40和 Αβ 42 (Αβ 42更容易聚集，毒性更強)，它們是由澱粉樣蛋白前體依次經過β和Y-分泌酶定點酶切而產生的。對AD患者的診斷當前主要是依據其記憶和行為的部分喪失，對於潛伏期患者的病理診斷是一個具有挑戰意義的世界前沿課題。據醫學相關資料顯示，在全球已有的MOO萬老年性痴呆患者中，我國約佔1/4， 並以每年100萬的速度遞增。當前，對無症狀的AD患者的檢測最常用的技術有磁共振成像(magnetic resonance Imaging，MRI )、正電子發身寸成像(positron emission tomography，PET)禾口光學成像(optical imaging)、表面增強拉曼(surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)光譜、掃描電化學顯微鏡(scanning electrical microscopy, SEM)技術和電化學方法等。MRI的靈敏度較低，在臨床醫學難以有效利用；PET價格太高， 而且目前可供選擇的同位素標記的PET探針較小，這些大大限制了其廣泛應用。電化學方法需要複雜的電極製備過程。內源螢光法檢測β澱粉樣蛋白聚集體的文獻也有報導，但是，發內源螢光的色氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸的激發波長和發射波長都處於紫外區，難以直接成像觀察，且量子產率較低，檢測靈敏度較低。螢光探針可以吸附或者共價結合到蛋白質上，導致其螢光特性(發射波長、螢光強度、螢光偏振度等)發生變化，進而可以對蛋白質進行定性和定量研究。目前，在A β的螢光檢測中最常用的螢光探針有硫磺素(Thioflavin， ThT)、剛果紅(Congo Red, CR)和 8-苯氨基-1-萘磺酸(8-Anilino-l-naphthalenesulfon ic acid，ANS)等。這些探針都是通過疏水作用和蛋白質相結合，引起螢光探針螢光特性的變化，所以，特異性很差；另外，這些探針的檢測重複性都很差；這些探針也無法檢測澱粉體形成過程中出現的一些中間體。再加上，β澱粉樣蛋白在體液中含量低，聚集速度較慢， 所以，設計合成能監測β澱粉樣蛋白聚集過程的超靈敏促動器和傳感器，開發出對老年性痴呆患者早期診斷的醫用試劑盒，可以使很多早期患者早發現、早治療，大大減少患者的身體痛苦和經濟負擔。Roberti等發現將Αβ的姊妹蛋白α-同核蛋白(α-synuclein)修飾在量子點(Qdot 605)上之後，形成一個可以促進α-synuclein聚集的成核中心，該方法可以快速、靈敏地研究a-synuclein在活細胞內的聚集過程。Jovin等在螢光物質芘上通過共價鍵偶聯馬來醯亞胺(maleimide)，在a -synuclein上將惰性的丙氨酸突變為含有羥基的半胱氨酸((Cysteine，Cys))，利用馬來醯亞胺與巰基的高親和性，在a-synuclein的三種突變體上標記了芘分子。利用芘聚集後形成激基締合物(excimer)後產生的發射峰來檢測α -synuclein的聚集。儘管芘分子可以形成激基締合物，但是，由於激基締合物在470 nm處的螢光峰較小，所以，只能定性地說明形成了聚集體，無法準確地定量說明聚集程度。7 (aggregation induced emission enhancement,AIEE)Mit^ 物是近年來螢光探針方面的一個研究熱點。由於其特殊的分子結構，其在有機溶劑中螢光很弱甚至不發光，如果其存在的溶劑環境極性增加，或者化合物以聚集體或者固體形式存在時，分子內本來可以自由旋轉的一些取代基旋轉受阻，這樣強烈地抑制了螢光分子的非輻射失活過程，導致AIEE型化合物的螢光大大增強。如果在A β 42或者A β 40上特異性地標記上一種AIEE型化合物分子，A β 42或者A β 40分子的聚集必然導致AIEE型化合物的聚集，螢光增強。可以定性或定量地監測β澱粉樣蛋白聚集過程，將用其於潛伏期老年性痴呆患者的病理診斷，具有很好的應用前景，目前還未見相關文獻報導。
發明內容
本發明目的是提供一種可以高靈敏、高選擇性地監測β澱粉樣蛋白聚集過程的聚集誘導發光新方法，為老年痴呆症等疾病的早期診斷提供有益信息。為實現本發明目的，本發明利用馬來醯亞胺與半胱氨酸上巰基的高親和性，將β 澱粉樣蛋白特異性地結合在聚集誘導螢光探針上，基於聚集誘導發光增強現象，高靈敏、高選擇性地監測β澱粉樣蛋白聚集過程，從而定性或定量地監測人體內β澱粉樣蛋白變化。具體技術方案首先合成具有聚集誘導發光增強效應的螢光探針，利用共價鍵在聚集誘導螢光探針分子上偶聯馬來醯亞胺，將β澱粉樣蛋白42分子上的第2位的甘氨酸突變成半胱氨酸，利用馬來醯亞胺與半胱氨酸上巰基的高親和性，將β澱粉樣蛋白特異性地結合在聚集誘導螢光探針上，用聚集誘導發光增強法監測β澱粉樣蛋白的聚集過程。具體通過以下步驟實現
1)將Αβ42分子上的第2位的甘氨酸突變成半胱氨酸的β-澱粉樣蛋白溶解在磷酸鹽緩衝溶液中；
2)然後加入如下結構的具有聚集誘導發光增強效應的螢光探針
權利要求
1. 一種利用聚集誘導發光監測β澱粉樣蛋白聚集過程的方法，其特徵在於，通過以下步驟實現1)將Αβ42分子上的第2位的甘氨酸突變成半胱氨酸的β-澱粉樣蛋白溶解在磷酸鹽緩衝溶液中；2)然後加入如下結構的具有聚集誘導發光增強效應的螢光探針
2.如權利要求1所述的一種利用聚集誘導發光監測β澱粉樣蛋白聚集過程的方法，其特徵在於，磷酸鹽緩衝溶液為0. 2 Μ，ρΗ 7. 4緩衝溶液。
全文摘要
本發明公開了一種利用聚集誘導發光監測β澱粉樣蛋白聚集過程的方法，屬於生物醫學研究和臨床檢測技術領域。該方法利用馬來醯亞胺與半胱氨酸上巰基的高親和性，將β澱粉樣蛋白特異性地結合在聚集誘導螢光探針上。基於聚集誘導發光增強現象監測β澱粉樣蛋白的聚集過程。該方法具有高靈敏、高選擇性、穩定性好，易控制，製作成本低廉等優點。可以監測微摩爾甚至納摩爾的Aβ42和Aβ40含量，且檢測速度比利用ANS(8-苯胺-1-萘磺酸)等探針的監測方法提高15倍。可以定性或定量地監測β澱粉樣蛋白聚集過程，將用其於潛伏期老年性痴呆患者的病理診斷，具有很好的應用前景。
文檔編號G01N33/68GK102279270SQ20111010579
公開日2011年12月14日 申請日期2011年4月27日 優先權日2011年4月27日
發明者宋勝梅, 徐茂田, 朱旭, 王永祥, 王靜, 瞿鵬 申請人:商丘師範學院