一種鹽生杜氏藻快速培養方法
2023-04-27 01:35:36
一種鹽生杜氏藻快速培養方法
【專利摘要】本發明公開了一種鹽生杜氏藻快速培養方法，屬水產養殖領域。傳統上，鹽生杜氏藻採用開放式跑道水泥池並使用f/2培養液配方培養，生長慢，易汙染，產量低，β-胡蘿蔔素含量低，品質差，效益低。為了克服傳統培養方法缺點，本發明採用光照培養箱培養並在培養液中添加了硝酸銨，尿素，磷酸二氫鉀，碳酸氫鈉，檸檬酸鐵，維生素B1，維生素B12，920植物生長刺激素等營養成分，在培養的後期補充營養鹽並提高光照強度和溫度，促進藻細胞持續生長並脅迫β-胡蘿蔔素積累，生長快，產量高，不易汙染，品質好，操作簡便，投資少，效益高。
【專利說明】_種鹽生杜氏藻快速培養方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於水產養殖領域，尤其涉及一種鹽生杜氏藻快速培養方法。
【背景技術】
[0002]鹽生杜氏藻Dunaliella salina是一種生長在內陸鹽湖的雙鞭毛單細胞綠藻，經馴化後可在普通海水中生活。隸屬綠藻門、綠藻綱、團藻目、鹽藻科、鹽藻屬。細胞卵圓形、橢圓形或梨形，長18-28 μ m，寬9.5-14 μ m，在不同鹽度、光照、溫度下形態變化較大。細胞前端呈凹陷狀，在凹陷處生出兩條等長鞭毛，鞭毛比細胞長約1/3 ;鞭毛基部有一紅色眼點。體內有一杯狀色素體，主要是葉綠素和類胡蘿蔔素(以胡蘿蔔素為主)。無性繁殖，藻體在運動中縱裂為二，各形成一個新體。細胞含豐富油脂、β-胡蘿蔔素、蛋白質、多糖、較高的Ca、P、Zn等，還含包括人類必需胺基酸在內的18種胺基酸，累積的甘油為乾重的40-50%。在適當的條件下，細胞內合成的胡蘿蔔素可達細胞乾重的14%上。在食品、醫藥保健以及化工和養殖業中具有獨特經濟價值，在澳大利亞、美國和以色列已實現了工業化生產，主要是用作胡蘿蔔素類保健品、化妝品、營養補充劑和藻粉等。
[0003]傳統上，鹽生杜氏藻採用開放式跑道水泥池並使用f/2培養液配方培養，生長慢，易汙染，產量低，胡蘿蔔素含量低、品質差，效益低。為了克服鹽生杜氏藻傳統培養方法缺點，本發明採用光照培養箱培養並在培養液中添加了硝酸銨，尿素，磷酸二氫鉀，碳酸氫鈉，檸檬酸鐵，維生素B1，維生素B12,920植物生長刺激素等營養成分，在培養的後期補充營養鹽並提高光照強度和溫度，促進藻細胞持續生長並脅迫胡蘿蔔素積累，培養液營養全面、持久，生長快，產量高，不易汙染，品質好，操作簡便，技術性要求不高，投資少，效益尚O
【發明內容】
[0004]為了克服目前技術的不足，本發明提供了一種鹽生杜氏藻快速培養方法，具體方法如下:
[0005]步驟I培養液的配製；取一 3000毫升的三角燒瓶，裝入煮沸冷卻後的海水2000毫升，加入硝酸銨5克，尿素3克，磷酸二氫鉀1.5克，碳酸氫鈉18克，檸檬酸鐵0.2克，維生素B1 0.02毫克，維生素B12 0.1毫克，920植物生長刺激素0.01毫克，EDTA鈉鹽0.01克，保鮮膜封口，放在搖床上搖勻15分鐘，保存備用。
[0006]步驟2接種；取一 1000毫升的三角燒瓶，加入步驟I所配好的培養液500毫升，用處於對數生長期藻、生長旺盛、無汙染的鹽生杜氏藻藻種接種，接種後的密度達到2.5Χ 14Cell/每毫升，高壓滅菌鍋消毒後的報紙和橡皮筋封口。
[0007]步驟3光照培養箱培養；將步驟2接種後的三角燒瓶置入光照培養箱培養，培養的前5天，光照強度設為25001χ，設置溫度為25±1°C，其中光/暗周期12L/12D，即提供間歇光，12小時光照，12小時黑暗；第6、7、8天光照強度設為60001χ，第9天後提供較高的光照和溫度，以脅迫β -胡蘿蔔素的積累，光照強度150001Χ，溫度30°C。每天用手搖動6次，每次120秒鐘。
[0008]步驟4補充營養液；從第6天開始，每天添加步驟I所述營養液50毫升，以補充營養鹽的消耗。然後輕輕搖瓶90秒鐘，放回光照培養箱，繼續培養。
[0009]步驟5藻細胞採收；培養至第11天，細胞密度達到125 X 14Cell/每毫升藻液，停止培養，將培養瓶從光照培養箱中取出，關閉培養箱電源。將藻液用離心機離心採收藻細胞，離心機轉速5000轉/每分鐘，離心5分鐘，棄上清液，可得牙膏狀的藻泥，採收完畢。
[0010]有益結果
[0011]傳統上，鹽生杜氏藻採用開放式跑道水泥池並使用f/2培養液配方培養，生長慢，易汙染，產量低，胡蘿蔔素含量低、品質差，效益低。為了克服鹽生杜氏藻傳統培養方法缺點，現在我採用光照培養箱培養並在培養液中添加了硝酸銨，尿素，磷酸二氫鉀，碳酸氫鈉，檸檬酸鐵，維生素B1，維生素B12,920植物生長刺激素等營養成分，在培養的後期補充營養鹽並提高光照強度和溫度，促進藻細胞持續生長並脅迫胡蘿蔔素積累，培養液營養全面、持久，生長快，產量高，不易汙染，品質好，操作簡便，技術性要求不高，投資少，效益尚O
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為鹽生杜氏藻形態結構圖；
[0013]其中附圖標識為I紅色眼點，2蛋白核，3色素體，4鞭毛；
[0014]圖2為鹽生杜氏藻生長情況圖；
[0015]圖2，其中橫坐標為培養時間(天)，縱坐標為細胞密度，單位是X14Cell/每毫升藻液。
【具體實施方式】
[0016]步驟I培養液的配製取一 3000毫升的三角燒瓶，裝入煮沸冷卻後的海水2000毫升，加入硝酸銨5克，尿素3克，磷酸二氫鉀1.5克，碳酸氫鈉18克，檸檬酸鐵0.2克，維生素B1 0.02毫克，維生素B12 0.1毫克，920植物生長刺激素0.01毫克，EDTA鈉鹽0.01克，保鮮膜封口，放在搖床上搖勻15分鐘，保存備用；
[0017]步驟2接種取一 1000毫升的三角燒瓶，加入步驟I所配好的培養液500毫升，用處於對數生長期、生長旺盛、無汙染的鹽生杜氏藻藻種接種，接種後的密度達到2.5X 14Cell/每毫升，高壓滅菌鍋消毒後的報紙和橡皮筋封口 ；
[0018]步驟3光照培養箱培養將步驟2接種後的三角燒瓶置入光照培養箱培養，培養的前5天，光照強度設為25001χ，設置溫度為25±1°C，其中光/暗周期12L/12D，即提供間歇光，12小時光照，12小時黑暗；第6、7、8天光照強度設為60001χ，第9天後提供較高的光照和溫度，以脅迫β -胡蘿蔔素的積累，光照強度150001Χ，溫度30°C。每天用手搖動6次，每次120秒鐘；
[0019]步驟4補充營養液從第6天開始，每天添加步驟I所述營養液50毫升，以補充營養鹽的消耗。然後輕輕搖瓶90秒鐘，放回光照培養箱，繼續培養；
[0020]步驟5藻細胞採收培養至第11天，細胞密度達到125 X 14Cel I/每毫升藻液，停止培養，將培養瓶從光照培養箱中取出，關閉培養箱電源。將藻液用離心機離心採收藻細胞，離心機轉速5000轉/每分鐘，離心5分鐘，棄上清液，可得牙膏狀的藻泥，採收完畢；
[0021]步驟I中因檸檬酸鐵(FeC6H5O7.5Η20)較難溶解，可加少量自來水在火爐上微熱至80-90°C，並不斷攪拌至全部融化；
[0022]步驟I中920植物生長刺激素為白色結晶粉末，不易溶解於水，可先用酒精充分溶解(一般每克用50毫升酒精或60度白酒溶解I小時以上)，再按所需濃度兌水稀釋；
[0023]步驟2中接種用的鹽生杜氏藻預先進行提純(本領域常規方法，只要可實現提純即可，例如凱氏提取法)，以確保接種時藻種處於生長旺盛的對數生長期；
[0024]步驟I中各種營養鹽要按配方中提供的順序加入，以免發生化學反應；
[0025]步驟I中各種無機物營養鹽和維生素可預先配成母液且置於4°C冰箱冷藏保存備用，放置時間不要超過45天；
[0026]步驟I和2中所用三角燒瓶等玻璃儀器均需洗刷乾淨放在70°C烘箱中烘乾後使用。
[0027]步驟I中所用化學藥品純度均需化學純級別。
[0028]最後應說明的是:以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解:其依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換；而這些修改或者替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明實施例技術方案的精神和範圍。
【權利要求】
1.一種鹽生杜氏藻快速培養方法，其特徵在於具體步驟如下: 步驟I培養液的配製；取一 3000毫升的三角燒瓶，裝入煮沸冷卻後的海水2000毫升，加入硝酸銨5克，尿素3克，磷酸二氫鉀1.5克，碳酸氫鈉18克，檸檬酸鐵0.2克，維生素B10.02毫克，維生素B120.1毫克，920植物生長刺激素0.01毫克，EDTA鈉鹽0.01克，保鮮膜封口，放在搖床上搖勻15分鐘，保存備用； 步驟2接種；取一個1000毫升的三角燒瓶，加入步驟I所配好的培養液500毫升，用處於對數生長期、生長旺盛、無汙染的鹽生杜氏藻藻種接種，接種後的密度達到.2.5X 14Cell/每毫升，高壓滅菌鍋消毒後的報紙和橡皮筋封口 ； 步驟3光照培養箱培養；將步驟2接種後的三角燒瓶置入光照培養箱培養，培養的前5天，光照強度設為25001x，設置溫度為25土 1°C，其中光/暗周期12L/12D，即提供間歇光，.12小時光照，12小時黑暗；第6、7、8天光照強度設為60001χ，第9天後提供較高的光照和溫度，以脅迫β-胡蘿蔔素的積累，光照強度150001Χ，溫度30°C。每天用手搖動6次，每次.120秒鐘； 步驟4補充營養液；從第6天開始，每天添加步驟I所述營養液50毫升，以補充營養鹽的消耗。然後輕輕搖瓶90秒鐘，放回光照培養箱，繼續培養； 步驟5藻細胞採收；培養至第11天，細胞密度達到125 X 14Cell/每毫升藻液，停止培養，將培養瓶從光照培養箱中取出，關閉培養箱電源。將藻液用離心機離心採收藻細胞，離心機轉速5000轉/每分鐘，離心5分鐘，棄上清液，可得牙膏狀的藻泥，採收完畢。
【文檔編號】C12N1/12GK104480015SQ201410680313
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月25日 優先權日:2014年11月25日
【發明者】王培磊 申請人:臨沂大學