一種煙麴黴蛋白單克隆抗體及其製備方法和用途
2023-04-26 15:41:51 1
一種煙麴黴蛋白單克隆抗體及其製備方法和用途
【專利摘要】本發明公開了一種煙麴黴蛋白單克隆抗體及其製備方法和用途。該單克隆抗體是由保藏於CGMCC保藏號為CGMCC?No.6606的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體；該製備方法通過克隆煙麴黴蛋白的基因；將克隆的基因插入表達載體，構建重組表達載體；用重組表達載體轉化感受態大腸桿菌，誘導表達，親和層析，得到純化的該煙麴黴蛋白的重組蛋白；用該重組蛋白接種小鼠，取其脾淋巴細胞與小鼠Sp2/0骨髓瘤細胞融合，建立雜交瘤細胞系，從中篩選出分泌該煙麴黴蛋白抗體最穩定、抗體活性最高的雜交瘤細胞株，它們所產生的抗體即為所需的單克隆抗體；該單克隆抗體可製備麴黴病診斷試劑。該單克隆抗體的具有高度特異性和強親和力，製備方法簡單高效。
【專利說明】一種煙麴黴蛋白單克隆抗體及其製備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程、細胞工程和麴黴病的免疫診斷領域，涉及一種煙麴黴蛋白單克隆抗體及其製備方法和用途。
【背景技術】
[0002]近期研究證明，以測定真菌抗原、抗體和循環代謝產物為基礎的血清學診斷方法潛力較大[1~4]。麴黴在體內發生侵襲性感染時，由孢子狀態延伸生長成菌絲，此時向體液中釋放菌絲蛋白，並刺激機體產生抗體。鑑於麴黴感染的這個特徵，一般認為，血循環中抗原或特異抗體水平上升，預示著菌絲體延伸和/或麴黴感染的發展。由於麴黴蛋白質成分複雜，而且基礎疾病、前期用藥不同的病人其機體處於不同免疫狀態，導致體內麴黴抗原、抗體種類和量也有差別[5~8]。因此，作為實驗室診斷用的目標抗原和抗體，應該選擇在不同免疫狀態的病人罹患侵襲性麴黴病時，在其體內優勢大量表達、並能夠強烈刺激人體產生抗體的麴黴蛋白質抗原組分。
[0003]我們用免疫蛋白質組學法篩選煙麴黴免疫優勢抗原時[9]，發現了一個與確診侵襲性麴黴病(IA)血清發生強免疫反應的新的煙麴黴蛋白，即硫氧還蛋白還原酶GliT (TR)，分子量約36.2KDa。用SignalP軟體預測結果顯示，TR帶有信號肽(signalP probability, 0.808) ；WoLF PSORT 軟體預測結果顯示 TR 為胞外蛋白(Query Protein WoLFPSORTprediction:extr, 12.0; cyto, 6.5 ；cyto_nucl, 4.0 ；mito, 3.0 ；pero, 2.0);用 BLAST 程序進行同源性分析顯示，TR與人源性蛋白質沒有同源性，與其他真菌蛋白質的同源性也很低，如與白念珠菌蛋白質的同源性為25%，熱帶念珠菌25%，光滑念珠菌24%，季也蒙念珠菌27%，釀酒酵母菌24%，馬爾尼菲青黴27%[1°]，是一個理想的診斷標誌物。TR可以作為煙麴黴的特異性抗原用於麴黴病尤其是IA的血清學診斷。
[0004]為此，我們克隆表達了該蛋白，並建立了 ELISA法來檢測血清中的ant1-TR水平，結果顯示，煙麴黴孢子感染一周後即出現ant1-TR抗體陽性，且抗體滴度快速上升。檢測血清ant1-TR抗體在免疫功能相對正常的非粒缺IPA患者中診斷的敏感性和特異性為80.9%和96%，明顯優於現有試劑盒GM的檢測(43.5%，p < 0.05) [10]。而聯合檢測ant1-TR抗體和抗原TR，可明顯提高檢測的敏感性。
[0005]因此，製備出特異性識別煙麴黴TR蛋白、且與之高親和力結合的單克隆抗體，用於配製診斷麴黴病的試劑組合物，是目前生物醫學領域亟待解決的問題。
[0006]參考文獻:
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【發明內容】
[0017]本發明的目的就是為了解決上述問題，提供一種針對煙麴黴TR的單克隆抗體。
[0018]本發明的另一個目的是提供該單克隆抗體的製備方法。
[0019]本發明還有一個目的是提供該單克隆抗體在製備麴黴病診斷試劑中的應用。
[0020]一種煙麴黴蛋白單克隆抗體，該單克隆抗體是由保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6606的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體。
[0021]本發明的單克隆抗體應理解為可以是IgG或IgM，也可以是該抗體的Fab片段、F(ab』)2片段、單鏈抗體等，其抗原結合片段保持該單克隆抗體的結合特徵。
[0022]分泌本發明所述單克 隆抗體的雜交瘤細胞Ant1-TRl，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC N0.6606，保藏時間為2012年9月24日。
[0023]可通過實質上通用的基因重組技術，獲得煙麴黴TR基因工程蛋白用於動物的免疫接種和篩選、鑑定抗體的抗原，但本發明優選表達載體pET_28a( + )，使目的基因的表達最有效，最易於純化。[0024]本發明所述的單克隆抗體的製備方法，包括以下步驟:
[0025]首先用基因工程技術製備煙麴黴TR蛋白:從煙麴黴菌絲中提取TR基因(SEQ IDN0.1)，對該基因進行克隆，並構建攜帶該基因的原核細胞表達載體，將該載體轉化入大腸桿菌，誘導被轉化的大腸桿菌高效表達重組TR蛋白。再用獲得的該基因工程蛋白接種小鼠，待動物體內對重組TR蛋白形成免疫應答後，從該動物體內提取脾淋巴細胞，與能在體外無限增殖的小鼠骨髓瘤細胞融合，建立雜交瘤細胞系，從該細胞系中篩選出所有能產生特異性抗體的細胞株。對產生抗體的這些細胞株進行反覆篩選和單克隆化培養，採用ELISA法對分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞進行篩選，對抗體效價進行測定，採用Western印跡法、免疫組織化學法、免疫細胞化學法以及阻斷試驗對所製備的單克隆抗體的特異性進行了鑑定，優選出抗體親和力最強，特異性最高的單克隆細胞株，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6606，該雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體即為本發明的單克隆抗體。[0026]一種用於診斷麴黴病的試劑組合物，該組合物含有作為活性成分的有效量的上述單克隆抗體。
[0027]本發明所述的單克隆抗體在製備麴黴病診斷試劑中的應用。
[0028]本發明所述的雜交瘤細胞系在製備麴黴病診斷試劑中的應用。
[0029]本發明的有益效果:
[0030]首先，本發明提供了一種單克隆抗體，該抗體能特異性結合於煙麴黴的TR蛋白，該抗體也能特異性結合於人或動物組織中煙麴黴的TR蛋白，包括釋放到外周血中的TR蛋白。
[0031]本發明單克隆抗體的具有高度特異性和強親和力，能用於診斷麴黴病的檢測試劑製備。
[0032]本發明所製備的單克隆抗體可適用於檢測麴黴病病人的體液中的TR蛋白，以幫助判斷真菌的類型。
[0033]本發明所製備的單克隆抗體適用於檢測病人病變組織中麴黴表達的TR蛋白，以幫助判斷真菌的類型。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034]圖1:RT_PCR擴增煙麴黴TR DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖
[0035]其中:M.DNA分子量標準；1.陰性對照2.RT-PCR產物。
[0036]圖2:瓊脂糖凝膠電泳分析重組質粒PMD18-T/TR的酶切鑑定圖
[0037]其中:M，DNAmarker ;1，pMD18_T/TR 質粒雙酶切；2，pMD18_T/TR 質粒
[0038]圖3:TR基因的DNA測序分析。
[0039]圖4:重組TR的SDS-PAGE分析圖
[0040]其中:1，誘導的pET28a ( + )/TR菌體超聲破碎上清；2，未誘導轉化菌；3，純化的重
[0041]組蛋白質；M,蛋白質分子量marker。
[0042]圖5:重組TR蛋白的質譜鑑定圖譜及肽段匹配情況
[0043]其中:A，重組TR蛋白的質譜鑑定圖；B，與TR匹配的肽段(黑體標示)
[0044]圖6:ffestern blot印跡鑑定TR單克隆抗體的特異性[0045]圖7 JsoStrip小鼠單克隆抗體亞類(型)測定結果。
[0046]圖8:TR單克隆抗體與麴黴的間接免疫螢光分析圖:抗TR單克隆抗體與煙麴黴、黃麴黴和黑麴黴的TR發生特異性結合反應。
[0047]圖9:1A兔模型肺組織免疫組織化學分析的光鏡圖之一:IA兔模型肺組織中麴黴菌絲表達的TR與抗TR單克隆抗體發生特異性結合，菌絲染成黃褐色。
[0048]圖10:1A兔模型肺組織免疫組織化學分析的光鏡圖之二:IA兔模型肺組織中麴黴菌絲表達的TR與抗TR單克隆抗體的反應被游離的TR蛋白所阻斷，未出現黃褐色菌絲。
[0049]圖11:1A患者肺組織免疫組織化學分析的光鏡圖之一:IA患者肺組織中麴黴菌絲表達的TR與抗TR單克隆抗體發生特異性結合，菌絲染成黃褐色。
[0050]生物材料保藏信息
[0051]Ant1-TRl，分類命名為分泌抗曲美硫氧還蛋白還原酶GliT(TR)單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCN0.6606，保藏地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2012年9月24日。
【具體實施方式】
[0052]以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。
[0053]實施例1:煙麴黴蛋白TR基因的克隆及原核表達
[0054]要製備TR單克隆抗體，首先要進行TR基因的克隆和原核表達，為製備TR單克隆抗體奠定基礎。我們利用RT-PCR法和T/A克隆策略，從煙麴黴菌絲中克隆TR基因，經過PCR、雙酶切鑑定後，進行DNA測序(SEQ ID N0.1)0然後，構建重組表達載體pET_28a (+)/TR,經過PCR和雙酶切鑑定後，轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，IPTG誘導表達和SDS-PAGE檢測重組TR，鈷離子親和層析純化重組蛋白。
[0055]1.1實驗標本:煙麴黴菌絲
[0056]1.2製備TR雙鏈cDNA片段
[0057]1.2.1引物設計
[0058]用Primer5分析軟體設計，PCR引物序列如下:
[0059]TR 上遊引物(primerl):5' ~CACACATATGTCGATCGGCAAACTAC~3' (SEQ ID N0.2)(劃線處為Nde I酶切位點)
[0060]TR 下遊引物(primer2):5 ' ~ACTGAATTCCTATAGCTCCTGATCGAGACG~3 ' (SEQ IDN0.3)(劃線處為EcoR I酶切位點)。
[0061]1.2.2煙麴黴總RNA的提取
[0062]取50mg煙麴黴菌絲放入研缽中，立即加入適量的液氮，在菌絲呈凍結狀態下充分研磨，使之成為粉末狀，緊接著轉移至含Iml Trizol RNA提取液的離心管中，顛倒混勻，室溫放置15分鐘。加入0.2ml氯仿，充分混勻，4°C 12000rpm離心15分鐘。轉移上層無色水相至新的離心管中，加入0.5ml異丙醇，充分混勻，室溫放置10分鐘。4°C 12000rpm離心10分鐘，棄上清，加入1ml75%乙醇，渦旋振蕩，4°C 7500rpm離心5分鐘。棄上清，用50 μ IDEPC (焦碳酸二乙酯)處理水溶解RNA沉澱，8g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取的效果，將標本RNA溶液凍存在_70°C冰箱待用。[0063]1.2.3逆轉錄反應
[0064]總反應體系(20 μ I)組成如下:
[0065]
【權利要求】
1.一種煙麴黴蛋白單克隆抗體，該單克隆抗體是由保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6606的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的單克隆抗體，其抗原結合片段保持該單克隆抗體的結合特徵。
3.分泌權利要求1所述單克隆抗體的雜交瘤細胞Ant1-TRl，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6606，保藏日期為2012年9月24日。
4.權利要求1所述的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於包括以下步驟: a、克隆煙麴黴的一種蛋白的基因； b、將克隆的煙麴黴蛋白的基因插入表達載體，構建成重組表達載體； C、將構建的重組表達載體轉化感受態大腸桿菌，經異丙基硫代_β-D-半乳糖苷誘導獲得該煙麴黴蛋白高效表達產物，再經親和層析，得到純化的該煙麴黴蛋白的重組蛋白； d、用純化的該重組蛋白接種小鼠，取其脾淋巴細胞與小鼠Sp2/0骨髓瘤細胞融合,建立雜交瘤細胞系； e、從上述雜交瘤細胞系中篩選分泌該煙麴黴蛋白抗體的雜交瘤細胞株，選出最穩定、抗體活性最高的細胞株，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6606，該雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體即為權利要求1所述的單克隆抗體。
5.根據權利要求4所述的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於所述煙麴黴蛋白的基因是用逆轉錄PCR法從煙麴黴mRNA中擴增出煙麴黴硫氧還蛋白還原酶的cDNA。
6.根據權利要求4所述的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於所述表達載體優選pET_28a (+ )ο
7.一種用於診斷麴黴病的試劑組合物，其特徵在於所述的試劑組合物含有作為活性成分的有效量的權利要求1所述的單克隆抗體。
8.權利要求1所述的單克隆抗體在製備麴黴病診斷試劑中的應用。
9.權利要求3所述的雜交瘤細胞系在製備麴黴病診斷試劑中的應用。
【文檔編號】G01N33/577GK103897060SQ201210579111
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月28日 優先權日:2012年12月28日
【發明者】史利寧, 李芳秋 申請人:中國人民解放軍南京軍區南京總醫院