重組大腸桿菌、副雞禽桿菌抗原蛋白及其應用的製作方法

2023-04-26 14:28:16

重組大腸桿菌、副雞禽桿菌抗原蛋白及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於家禽家畜傳染病【技術領域】，具體涉及一種副雞禽桿菌免疫保護性抗原及其製備方法與應用。本發明製備得到了能夠分泌副雞禽桿菌抗原蛋白18d的表達菌株Escherichia coli BL21/pGEX-5X-1-18d，該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.8896。本發明還公開了適用於副雞禽桿菌的亞單位疫苗的抗原蛋白的製備方法及用途。
CGMCC No8896
20140305
【專利說明】重組大腸桿菌、副雞禽桿菌抗原蛋白及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於家禽傳染病疫苗製備【技術領域】，尤其涉及一種重組大腸桿菌、副雞禽 桿菌抗原蛋白及其應用。

【背景技術】
[0002] 副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum，Apg)為巴氏桿菌科的一種短小革 蘭氏陰性桿菌，基本特徵為無運動性、菌體呈多形性、強毒株帶有莢膜。1932年De Blieck 首先報導了自鼻道和鼻竇黏膜具有急性卡他性炎症、面部水腫和結膜炎的雞群中首次分 離出一種革蘭氏陰性桿菌。最初的研究報導指出該病原菌生長條件中既需要X(血紅素 晶）因子，也需要V(煙醯胺腺嘌啉二核苷酸，NAD)因子，早期的研究者將其命名為雞嗜血 桿菌（Haemophilus gallinarum)。1962年，Page等人研究發現所有IC病例的分離株生 長只需要V因子。因此，有學者提議將只需要V因子的雞嗜血桿菌命名為一個新種：副雞 嗜血桿菌（H. paragallinarum)，並被廣泛接受。近年來，在南非、墨西哥等地已從患鼻炎 的雞中分離到不依賴V因子的副雞嗜血桿菌菌株。因此，嚴格按照在體外生長因子需要進 行嗜血菌的分類並不科學。2005年，Blackall等將副雞嗜血桿菌的名稱改為副雞禽桿菌 (Avibacterium paragalIinarum)〇
[0003] 副雞禽桿菌作為雞的一種重要的呼吸道病原菌，常引起雞的傳染性鼻炎 (infectious coryza, IC)，該病在世界範圍內廣泛傳播，給養雞業造成愈來愈嚴重的經濟 損失。目前國內已有許多養雞場發生該病的報導。從感染部位來看，副雞禽桿菌感染的是 呼吸系統中最前沿的部位一鼻道和鼻竇黏膜，可以說是呼吸道疾病的門戶病。這第一屏障 被破壞，其他病原的感染率就大大增加。若與其它病原如雞傳染性支氣管炎病毒、雞支原 體、雞傳染性喉氣管炎等並發感染後引起雞呼吸道疾病症候群，會給養雞業造成更大的損 失。各種日齡的雞都易感該菌，常見於13周齡以上的雞，通常表現為低死亡率和高發病率， 產蛋率下降10%?40%。該病病理變化主要表現在上呼吸道急性卡它性炎症。典型症狀 是黏液性鼻竇炎，鼻竇黏膜水腫充血、黏膜杆狀細胞滲出，並且伴隨有異噬性白細胞和巨噬 細胞，產生典型的鼻炎病變。臨床表現為面部單側或雙側腫脹、流鼻涕，食慾下降、產蛋率下 降。控制該病通常應用抗生素結合綜合防治措施，鑑於Apg不同血清型之間缺乏交叉保護， 所以在未確定流行的病原菌的血清型之前，常用二價或三價滅活菌苗來免疫預防。由於Apg 含有脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS)等毒素物質，大量接種所帶來毒副作用也會影響 雞的產蛋與生長。
[0004] 雞傳染性鼻炎是一種呼吸道傳染病，目前主要靠滅活疫苗來控制。滅活疫苗的免 疫效果可能與所激發的黏膜抗體相關。研究表明A、B、C三個血清型的Apg均有不同程度的 致病力，但三者的滅活菌體不存在型間交叉免疫，只存在型內交叉免疫保護。目前國際上普 遍使用的滅活疫苗絕大多數都包含了 A型和C型，隨著國內外陸續發現有大量B型Apg的 流行和發生，國際上影響較大的疫苗公司已經開始提供包含A、B、C三種血清型的三價滅活 疫苗。雞傳染性鼻炎滅活疫苗對野外雞群感染的預防效果大約為70-80%，在其效力檢驗中 由於環境和評價方法的不盡一致可能會有不同的結果。
[0005] 常規滅活菌苗在使用過程中遇到了難以突破的難題，在生產中已經出現了型內不 能交叉保護的現象。辛巴威和南非的研究報導中也發現了同樣的問題。這樣就使副雞禽 桿菌滅活疫苗的使用陷入一個更為複雜的局面，即疫苗公司面臨著各地流行的變異株，需 要研製出包含各種變異株的菌苗。另一方面，由於副雞禽桿菌含有LPS等毒素物質，大量接 種所帶來毒副作用也會影響雞的產蛋與生長，因此導致了生產上免疫失敗時有發生。


【發明內容】

[0006] 本發明的第一個目的是獲得一株能夠分泌副雞禽桿菌免疫保護性抗原蛋白的重 組大腸桿菌，利用該重組大腸桿菌獲得免疫原性更好的保護性抗原蛋白，利用該保護性抗 原蛋白製備一種適用於預防或/和防治副雞禽桿菌的亞單位疫苗。
[0007] 本發明的第二個目的在於將所製備的重組大腸桿菌在製備副雞禽桿菌亞單位疫 苗中的應用。
[0008] 為了實現本發明的目的， 申請人:通過製備獲得一株能夠分泌副雞禽桿菌免疫保護 性抗原（編碼基因登錄號-FJ965542. 1，其編碼基因序列如SEQ No. 1所示）的重組大腸杆 菌（Escherichia coil)BL21/pGEX-5X-l-18d，該菌株已於2014年3月5日送交中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 8896。
[0009] 本發明通過克隆表達副雞禽桿菌抗原蛋白18d，對18d的特性進行實驗分析，證明 了該抗原蛋白具有較好的免疫原性，免疫試驗雞後能誘導較高抗體水平，並主要誘導體液 免疫。攻毒保護力實驗表明該蛋白能夠明顯增強雞對副雞禽桿菌的抵抗力，是一種很好的 免疫保護性抗原，可以作為副雞禽桿菌亞單位疫苗的候選抗原。
[0010] 生物保藏說明
[0011] 重組大腸桿菌：分類命名：大腸埃希氏菌（Escherichia coil)BL21/ pGEX-5X-l-18d，該菌株已於2014年3月5日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心（CGMCC)，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所， 保藏編號為CGMCC No. 8896。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為本發明實施例提供的PGEX-5X-1質粒圖譜；
[0013] 圖2為本發明重組抗原蛋白18d基因 PCR擴增結果，其中，M為DNA標準DL2000 ; 1為18d基因的擴增片段，2為空白對照；
[0014] 圖3為重組質粒雙酶切鑑定結果，其中，M為DNA標準DL2000 ;1為重組質粒的雙 酶切結果，2為pGEX-5X-l質粒；
[0015] 圖4為本發明重組質粒誘導表達後不同溫度的SDS-PAGE，其中，M為標準低分子質 量蛋白，1-3為pGEX-5X-18d以28°〇、32°〇、371：誘導全菌檢測結果 ；
[0016] 圖5為本發明重組質粒誘導表達後不同時間的SDS-PAGE，其中，M為標準低分子質 量蛋白，1為pGEX-5X-18d誘導7h全菌檢測結果，2為空載體28°C誘導6h全菌檢測結果； 3-7 為 28°C pGEX-5X-18d 誘導 6、5、4、3、2h 全菌檢測結果；
[0017] 圖6為本發明重組抗原蛋白18d純化後的SDS-PAGE，其中，M為標準低分子質量蛋 白，1為純化後18d蛋白；
[0018] 圖7為本發明重組抗原蛋白18dWestern_blotting檢測結果，其中，M為標準低分 子質量蛋白，1為對照菌，2為18d純化蛋白。

【具體實施方式】
[0019] 實施例1 :副雞禽桿菌重組抗原蛋白18d的原核表達
[0020] 1.材料
[0021] 1.1質粒與菌株
[0022] 本發明採用的pGEX-5X_l質粒（Pharmacia公司產品，購自北京鼎國昌盛生物技術 有限責任公司）；該PGEX-5X-1質粒圖譜如圖1所示，圖1為本發明實施例提供的pGEX-5X-l 質粒圖譜。
[0023] 大腸埃希氏菌BL21(DE3)感受態購自北京天根生物技術有限公司。
[0024] 本發明所用菌株為副雞禽桿菌hp8菌株，購自中國北京中國獸醫藥品監察所，屬 於一個商業菌株。
[0025] 1. 2副雞禽桿菌抗原18d :編碼該副雞禽桿菌抗原的鹼基序列如SEQ No. 1所示， GenBank No. FJ965542. 1:717-125。
[0026] 1. 3主要試劑及緩衝液（Buffer)
[0027] 氯化鈉、EDTA二鈉鹽、乙醇、甲醇、麗春紅S、三氯乙酸（TCA)是上海國藥公司產品。 Tris鹼（Tris-HCL)、二硫蘇糖醇（DTT)、甘油、十二烷基磺酸鈉（SDS)、丙烯醯胺、過硫酸銨、 四甲基乙二胺（TEMED)，碳酸鈉、乙酸鈉購白上海生工生物工程技術有限公司。甘氨酸、考馬 斯亮藍R-250購自AMRESC0公司。牛血清白蛋白（BSA)、胰酶、蛋白酶抑制劑（PMSF)、甲醛均 為Sigma公司產品。蛋白酶K (貯存液濃度為20mg/ml，使用液濃度為lmg/ml)購自上海華 舜生物工程有限公司。氨苄青黴素（Ampcillin)、胎牛血清、誘導劑IPTG (異丙基-β-D-硫 代半乳糖苷）均為Invitrogen公司產品。吸頭與離心管是AxyGen公司產品。Taq酶及 IOxTaq酶Buffer、Bam HI、Xhol I等核酸內切酶及相關Buffer、T4連接酶及10χΤ4連接酶 Buffer、Rnase、DNA marker(DL-2000、DL-15000)均為寶生物（大連）有限公司產品。柱式 離心式DNA凝膠回收試劑盒、辣根過氧化物酶（HRP)標記的兔抗雞IgG購自Sigma公司。底 物液配製：底物液A :0. 006 % H2O2緩衝液；底物液B :取Na2HPO4. 12H2014. 2g，檸檬酸10. 5g， 用雙蒸水定容至500mL配成0. 1磷酸鹽檸檬酸緩衝液（pH5. 0)，然後加上聯苯二胺（TMB)。 使用時將A液和B液等體積混合，混合後5分鐘內使用，現配現用。
[0028] 大腸桿菌培養基：LB液體培養液及固體培養基：每升含酵母提取物5g，胰蛋白腖 10g，NaCl 10g，用 10mol/L NaOH 調 pH 至 7.5，121°C 高壓滅菌 20min，4°C 保存備用。在每 100毫升LB液體培養基中加入I. 5g瓊脂即為固體LB培養基，121°C高壓滅菌20min，4°C保 存備用。
[0029] 副雞禽桿菌培養基TSB、TSA，及弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Sigma公 司。
[0030] 純化副雞禽桿菌抗原蛋白採用Sepharose4B純化柱（Amershan Pharmacia公司產 品）。
[0031] PBS 緩衝液：NaCI 8. 0g，KCl 0· 2g，KH2PO4 0· 24g，Na2HPO4 · 12Η203· 628g，溶於 800ml蒸餾水中，用鹽酸調pH值為7. 4,蒸餾水定容至1000ml，121 °C高壓滅菌20min，室溫 保存。
[0032] Western-blotting 緩衝液：
[0033] 電轉緩衝液：39mmol/L 甘氨酸，48mmol/L Tris 鹼，0. 037% SDS(電泳級），20% 甲 醇。配製IOOOmL轉移緩衝液，需稱取2. 9g甘氨酸，5. 8g Tris鹼，0. 37g SDS，加200mL甲 醇,加 ddH20至總量為1000mL。
[0034] TBS(pH8. 0)緩衝液：10mmol/L Tris. HC1，150mmol/L NaCl。
[0035] TBST緩衝液：在上述TBS中加入終濃度為0. 05% Tween-20即可。
[0036] 麗春紅S(IOX) I&存液：2g麗春紅S，30g三氯乙酸，30g磺基水楊酸，加 dd H2O至 IOOmL0
[0037] 質粒抽提相關溶液：
[0038] 溶液 I :含 0.05mol/L 葡萄糖，0.025mol/L Tris HCl(pH8.0)，0.01mol/L EDTA， 1211：高壓滅菌2〇1^11後置室溫備用。
[0039] 溶液 II:含 0· 2mol/LNa0H，1 % SDS，現配現用。
[0040] 溶液 III:取 5mol/L 乙酸鈉 60mL，冰乙酸 11. 5mL，水 28. 5mL，調 pH 至 5. 0。
[0041] 2mol/L NaOH :8g NaOH 加入 IOOmL dd H20。
[0042] 10% SDS :10g SDS加入80mL dd H2O中，加熱攪拌溶解，定容至100mL。
[0043] 5mol/L NH4Ac :327. 7g NH4AC 加入 CldH2O 中溶解，定容至 500mL。
[0044] 10mol/L NH4Ac :655. 4g NH4AC 溶於 ddH20,定容至 500mL。
[0045] 13 % PEG8_(1. 6mol/L NaCl) : 13g PEG8_，9. 35g NaCI，溶於 dd H2O，定 IOOmL, 121°C高壓滅菌20min。
[0046] 3mol/L NaAc :80mL dd H2O 中加入 40. 81g 醋酸納，定容至 lOOmL，121°C高壓滅菌 20min〇
[0047] 酚：氯仿：異戊醇（體積比為25:24:1):取飽和酚25mL、氯仿24mL、異戊醇lmL， 充分混勻後，用TE(pH8.0)覆蓋，於棕色瓶中保存。
[0048] 氯仿：異戊醇（體積比24:1):取氯仿48mL、異戊醇2mL，充分混勻後，用 TE(pH8.0)覆蓋，於棕色瓶中保存。
[0049] TE 溶液：lmmol/L EDTA，lOmmol/L Tris-Cl pH 值為 8. 0。
[0050] 試驗動物：6周齡SPF雞，購自北京梅裡亞維通SPF雞實驗動物中心。
[0051] 2.引物設計與合成
[0052] 根據副雞禽桿菌抗原18d的基因序列，應用引物設計軟體Primer 5.0,設計了用 於擴增18d基因的引物對，分別命名為18d-F和18d-R，分別具有如SEQ No. 2所示和SEQ No. 3所示的鹼基序列；分別在上下遊引物中引入BamHI和XhoI酶切位點，由華大基因（北 京）貿易有限公司合成，PCR擴增預期目標片段的大小為495bp。
[0053] 引物序列如下：
[0054] 18d-F :5' -GCGGATTCATGCTATCCAACTTAGATCA-3' (下劃線部分為 BamHI 酶切位 點）；
[0055] 18d-R :5' -CGCTCGAGTCAAGAGTAAGGTAAGGTAA-3,(下劃線 XhoI 酶切位點）
[0056] 3.抗原蛋白製備
[0057] 3. 1副雞禽桿菌（Apg)基因組DNA的提取
[0058] 1)副雞禽桿菌（Apg)菌培養
[0059] 將hp8株菌種接種於含有10%滅活新生牛血清的TSA培養基上，挑取單個菌落接 種於TSB液體培養基中，置於搖床中（150r/min)，37°C震蕩培養過夜。
[0060] 2)副雞禽桿菌（Apg)基因組DNA的提取
[0061] 取I. Oml菌液於I. 55ml的離心管中，8000r/min離心5min，棄上清。沉澱懸於 500ml TE (PH8. 0)中，加10 %的SDS，使其終濃度為1 %，然後加3 μ 1蛋白酶K (20mg/ml)， 37°C作用2h。離心取上清，用等體積的酚/氯仿抽提1次，上清用二倍體積的無水乙醇 在-2〇 1€沉澱1〇111；[11，120001'/111；[11離心20111；[11，沉澱用70(%的乙醇洗兩次，室溫放置20111；[11， 讓酒精揮發乾淨。沉澱用20 μ 1滅菌的去離子水溶解，-20°C保存。
[0062] 3)目的基因的擴增
[0063] 以上述方法提取的hp8株菌的基因組作為PCR模板。使用1. 4中所示的引物進行 PCR擴增。PCR反應體系如表1所示：
[0064] 表I PCR反應體系
[0065]

【權利要求】
1. 一種重組大腸桿菌，其特徵在於，其保藏編號為CGMCC No. 8896。
2. -種由權利要求1所述重組大腸桿菌分泌的副雞禽桿菌抗原蛋白。
3. -種由權利要求2所述重組大腸桿菌分泌的副雞禽桿菌抗原蛋白製備的亞單位疫 苗。
4. 權利要求1所述的重組大腸桿菌在製備副雞禽桿菌抗原蛋白中的應用。
5. 權利要求1所述的重組大腸桿菌在製備副雞禽桿菌亞單位疫苗中的應用。
【文檔編號】A61P31/04GK104371962SQ201410207226
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年5月15日 優先權日:2014年5月15日
【發明者】王宏俊, 張培君, 李淑芳, 龔玉梅, 李永清, 李桂萍, 趙成全 申請人:北京市農林科學院