利用兩性表面活性劑促進木質纖維素酶解及降溫回收纖維素酶的方法與流程

2023-05-08 23:01:06 1

本發明涉及木質纖維素酶解技術領域，特別涉及利用兩性表面活性劑促進木質纖維素酶解和回收纖維素酶的方法。

背景技術：

木質纖維素生物煉製燃料乙醇是替代汽油有效可行的技術之一。在這一煉製過程中，纖維素酶能否高效酶解木質纖維素底物是關鍵的技術瓶頸。同時,纖維素酶因其具有活力低、耗量大和價格高等特點,直接阻礙了纖維素乙醇的工業化。實現纖維素酶的高效回收利用是降低生物乙醇成本的重要途徑。目前,纖維素酶回收利用技術除了超濾膜回收和新鮮底物重吸附法回收。纖維素酶的固定化也是增加酶的穩定性減少纖維素酶費用的有效辦法。

研究者們將纖維素酶固定在二氧化矽晶片，二氧化矽，玻璃微珠，海藻酸鈣凝膠珠和磁性納米顆粒上。由於負載的纖維素酶不溶於水，其對可溶性的羧甲基纖維素有較好的水解能力，但是對於真實的木質纖維素底物酶解效率較低。為了讓纖維素酶水解效率高且方便回收，具有環境響應(如溫度、ph)的智能高分子成了人們研究的對象，由於調節ph過程需要消耗酸和鹼，採用具有溫度響應的聚合物來回收纖維素酶更加綠色環保，一些非離子聚合物如聚異丙基丙烯醯胺具有靈敏的溫度響應性質，將纖維素酶與這些非離子聚合物採用共價鍵結合在一起，可以使改性後的纖維素酶具有高溫析出和低溫溶解的性質。

通過具有醯胺基的甲基丙烯醯胺與n-異丙基丙烯醯胺(nipam)或n-異丙基甲基丙烯醯胺(nipma)的共聚合成了兩類具有最低臨界溶解溫度(lcst)的共聚物。實驗合成了lcst在20.9-60.5℃範圍內的一系列聚合物。將由嗜熱菌pyrococcushorikoshii產生的內切葡聚糖酶通過5-磷酸吡哆醛轉氨以產生含酮蛋白質，然後將轉氨後的纖維素酶與含有醯胺鍵的聚合物共聚合成生物綴合物。在兩次再循環後內切葡聚糖酶保持了60％以上的活性，並且與單獨的未修飾的酶相比可以產生更多的可溶性糖(journaloftheamericanchemicalsociety,2013,135:293-300.)。

通過n-異丙基甲基丙烯醯胺(nipma)與丙烯酸甲酯和n-(羥甲基)丙烯醯胺的聚合而成的熱響應聚合物(pnmn)用於與纖維素酶以形成生物綴合物。通過小分子猝滅，調節聚合物(pnmn)的lcst為51.6℃，此時回收率為98.5％，通過1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺將纖維素酶共價結合到pnmn合成生物綴合物(pnmn-c)，聚合物-纖維素酶生物綴合物在重複5次水解反應循環後依然保持了其初始活性的85.2％(journalofmolecularcatalysisb:enzymatic,2016,128:39-45.)。

但是溫敏性高分子負載纖維素酶仍然面臨著一些問題：1、在較高的溫度下回收纖維素酶，纖維素酶容易失活；2、將纖維素酶接枝在聚合物上時纖維素酶容易失活，3、纖維素酶是個多組分的酶系，其接枝反應和回收率不盡相同，回收影響酶系的活性。

技術實現要素：

為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的在於提供一種能耗少，綠色環保，只需要自然或通過製冷設備降低酶解液體的溫度就可以回收纖維素酶的利用兩性表面活性劑促進木質纖維素酶解並通過降溫來回收纖維素酶的方法。

本發明兩性表面活性劑需要具備適當的臨界溶解溫度(ucst)，使其在酶解溫度下40～60℃完全溶解在緩衝液中，酶解結束後，可以通過降溫的方法從酶解液體中沉澱出來。

本發明的目的通過下述方案實現：

利用兩性表面活性劑促進木質纖維素酶解及降溫回收纖維素酶的方法，包括以下步驟：將木質纖維素加入緩衝溶液中，再加入兩性表面活性劑和纖維素酶，加熱至40～60℃溫度下反應24～96h，得到木質纖維素的糖化水解液，通過固液分離後得到酶解液體，再降低酶解液體溫度使兩性表面活性劑和纖維素酶同時沉澱出來，進行循環利用；所述兩性表面活性劑的ucst為0～40℃。

為進一步實現本發明目的，優選地，所述兩性表面活性劑為胺基酸型兩性表面活性劑、甜菜鹼型兩性表面活性劑、磺基甜菜鹼型兩性表面活性劑和磷酸酯甜菜鹼兩性表面活性劑中的至少一種。

優選地，所述兩性表面活性劑為c8h18(ch3)2n+(ch2)oso3﹣、c12h26(ch2)2n+ch2po4﹣、c18h38(ch3)2n+o﹣、c14h30(ch3)2n+(ch2)3so3﹣、c16h34(ch3)2n+(ch2)3so3﹣和c8h17p(ch3)2o中至少一種。

優選地，通過固液分離得到酶解液體的方法為自然沉降法、傾析法、過濾法、離心法或這些方法的聯合使用。

優選地，降低酶解液體的溫度的方法為自然冷卻法或通過製冷設備冷卻。

優選地，所述緩衝溶液為ph＝4.5～6.2，離子強度為5～200mmol/l的醋酸-醋酸鈉緩衝液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液或磷酸鹽緩衝液。

優選地，所述木質纖維素為松木、桉木、楊木、水曲柳、沙棘、伯樹、杉木、樺木、玉米芯、玉米秸稈、麥稈、甘蔗渣、稻草、稻殼、食用菌基質和花生殼中的至少一種。

優選地，所述緩衝液的量為木質纖維素質量的5～50倍。

優選地，所述兩性表面活性劑與木質纖維素的質量比為10～50：100。

優選地，所述纖維素酶的用量以木質纖維素中的葡聚糖含量計為3～30fpu/g。

本發明的機理為：由於一般的兩性表面活性劑都具有臨界溶解溫度(ucst)，當溫度高於ucst時，兩性表面活性劑溶解於緩衝液中，減少纖維素酶在木質素上的無效吸附，促進木質纖維素的酶解；當溫度低於ucst時，兩性表面活性劑析出，由於兩性表面活性劑與纖維素酶有一定的疏水作用，所以在兩性表面活性劑析出時會將溶液中的纖維素酶一起沉澱下來。本發明兩性表面活性劑需要具備適當的臨界溶解溫度(ucst)，使其在酶解溫度下(40～60℃)完全溶解在緩衝液中，酶解結束後，可以方便的通過降溫的方法從酶解液體中沉澱出來。

本發明相對於現有技術，具有如下的優點及有益效果：

(1)本發明以兩性表面活性劑作為酶解助劑，對純纖維素的酶解沒有抑制作用，可使木質纖維素的酶解糖化得率提高13.7～72.1％。

(2)本發明中回收纖維素酶的操作簡單，只需要自然或通過製冷設備降低酶解液體的溫度就可以回收纖維素酶。

(3)本發明與目前普遍研究的將纖維素酶固定在非離子聚合物上通過升高溫度來回收纖維素酶相比可以避免纖維素酶的高溫失活和固定化反應的失活。

(4)本發明在操作的過程中不需要用到額外的設備，能耗小，綠色環保。

附圖說明

圖1為sb3-16在ph4.8(50mm)醋酸鈉緩衝液中的溶解度隨溫度的變化。

圖2是兩性表面活性劑促進木質纖維素酶解和通過降溫來回收纖維素酶的工藝流程圖，實施例1-6都是按工藝流程圖來進行操作，但是操作中沒有補加兩性表面活性劑和纖維素酶。

具體實施方式

為更好地理解本發明，下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的描述，但本發明的實施方式不限於此。下列實施例中所用試劑均可從市場購買得到。實施例中的微晶纖維素型號為ph101(購自西格瑪奧德裡奇)，纖維素酶是目前被廣泛使用的cellicctec2，底物包含有稀酸預處理的桉木(桉木-da)和酸性亞硫酸法處理過的松木(松木-sporl)；用到的兩性表面活性劑有sb3-16、c8apso4、c12pps和c18dao。水解液中葡萄糖濃度是通過生物傳感分析儀(sba-40e，山東省生物科學研究院)測定的。

實施例1

如圖2所示，取100質量份微晶纖維素，加入到5000質量份ph為4.8，離子強度為50mmol/l的醋酸-醋酸鈉緩衝溶液中，加入50質量份sb3-16，再加入10fpu/g以微晶纖維素質量計的纖維素酶，在50℃溫度下反應48h，反應結束後，離心分離獲得酶解液體，降低酶解液體的溫度至0℃，待溶液中出現大量沉澱時進行離心分離，再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩衝液)相同的樣品中再次酶解48h(不補充纖維素酶和兩性表面活性劑)，通過生物傳感分析儀測定兩次酶解的葡萄糖含量，統計結果如表1所示。

實施例2

如圖2所示，取100質量份桉木-da，加入到5000質量份ph為5.0，離子強度為25mmol/l的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝溶液中，加入50質量份sb3-16，再加入5fpu/g以底物中葡聚糖計的纖維素酶，在50℃溫度下反應48h，反應結束後，離心分離獲得酶解液體，降低酶解液體的溫度至0℃，待溶液中出現大量沉澱時進行離心分離,再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩衝液)相同的樣品中再次酶解48h(不補充纖維素酶和兩性表面活性劑)，通過生物傳感分析儀測定兩次酶解的葡萄糖含量，統計結果如表1所示。

實施例3

如圖2所示，取250質量份松木-sporl，加入到5000質量份ph為5.5，離子強度為100mmol/l的磷酸鹽緩衝溶液中，加入100質量份c12pps，再加入10fpu/g以底物中葡聚糖計的纖維素酶，在50℃溫度下反應72h，反應結束後，離心分離獲得酶解液體，降低酶解液體的溫度至0℃，待溶液中出現大量沉澱時進行離心分離,再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩衝液)相同的樣品中再次酶解72h(不補充纖維素酶和兩性表面活性劑)，通過生物傳感分析儀測定兩次酶解的葡萄糖含量，統計結果如表1所示。

實施例4

如圖2所示，取100質量份微晶纖維素，加入到5000質量份ph為4.8，離子強度為50mmol/l的醋酸-醋酸鈉緩衝溶液中，加入50質量份c8apso4，再加入10fpu/g以微晶纖維素質量計的纖維素酶，在45℃溫度下反應48h，反應結束後，離心分離獲得酶解液體，降低酶解液體的溫度至0℃，待溶液中出現大量沉澱時進行離心分離,再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩衝液)相同的樣品中再次酶解48h(不補充纖維素酶和兩性表面活性劑)，通過生物傳感分析儀測定兩次酶解的葡萄糖含量，統計結果如表1所示。

實施例5

如圖2所示，取100質量份桉木-da，加入到5000質量份ph為6.0，離子強度為25mmol/l的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝溶液中，加入50質量份c8apso4，再加入20fpu/g以底物中葡聚糖計的纖維素酶，在52℃溫度下反應48h，反應結束後，離心分離獲得酶解液體，降低酶解液體的溫度至5℃，待溶液中出現大量沉澱時進行離心分離,再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩衝液)相同的樣品中再次酶解48h(不補充纖維素酶和兩性表面活性劑)，通過生物傳感分析儀測定兩次酶解的葡萄糖含量，統計結果如表1所示。

實施例6

如圖2所示，取250質量份松木-sporl，加入到5000質量份ph為5.5，離子強度為100mmol/l的磷酸鹽緩衝溶液中，加入100質量份c18dao，再加入10fpu/g以底物中葡聚糖計的纖維素酶，在50℃溫度下反應72h，反應結束後，離心分離獲得酶解液體，降低酶解液體的溫度至0℃，待溶液中出現大量沉澱時進行離心分離,再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩衝液)相同的樣品中再次酶解72h(不補充纖維素酶和兩性表面活性劑)，通過生物傳感分析儀測定兩次酶解的葡萄糖含量，統計結果如表1所示。

以上實施例做了對應的空白對比例，空白樣是指其它酶解條件一樣，不加入兩性表面活性劑且酶解相同時間的樣品。纖維素酶蛋白回收率(r)是通過對比回收前後纖維素酶在278nm的紫外吸收峰計算得到：

h0是回收前纖維素酶溶液在278nm的紫外吸光度，h1是回收後剩下纖維素酶溶液在278nm的紫外吸光度。

根據表1中可以看出，兩性表面活性劑可以有效地促進木質纖維素的酶解，並且可以回收一定的纖維素酶，同時兩性表面活性劑也可以在過程中得到循環利用。

圖1為sb3-16在ph4.8(50mm)醋酸鈉緩衝液中的溶解度隨溫度的變化，說明了通過降低溫度回收纖維素酶的可行性。

圖2是兩性表面活性劑促進木質纖維素酶解和通過降溫來回收纖維素酶的工藝流程圖，過程中沒有涉及到複雜的工藝，不需要額外的設備，能耗低，綠色環保。

表1兩性表面活性劑促進木質纖維素酶解和回收纖維素酶的情況

本發明的實施方式不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。