禽卡氏桿菌pcr診斷試劑盒的製作方法
2023-05-09 00:42:31 1
專利名稱：禽卡氏桿菌pcr診斷試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種試劑盒，尤其是一種禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒。
背景技術：
禽卡氏桿菌病是近年來新發現的蛋雞的一種傳染病，是由卡氏桿菌 (Gallibacterium anatis)引起蛋雞群的一種產蛋量下降的疾病，臨床上以輸卵管囊腫和卵巢炎等為主要特徵。卡氏桿菌不僅是禽卡氏桿菌病的病原，而且還能夠引起其他多種禽類患病。卡氏桿菌常與雞減蛋症候群病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、黴形體、禽肺病毒等病原混合感染，使病情加重和複雜化，給養禽業帶來了巨大的經濟損失。卡氏桿菌為兩端鈍圓的球桿菌，有時呈現多形性，無芽孢，不運動。菌體單個散在或成對分布。革蘭氏染色陰性。 瑞氏和美蘭染色呈兩極著色，有明顯或微弱莢膜，需氧菌。目前已鑑定的卡氏桿菌有M個血清型。其中有3個致病性血清型，分別為1型、2型和4型。隨著研究的逐步深入，卡氏桿菌的血清型越來越趨於多樣化，在同一個雞場，血清型的分布也會有所不同；而且，各血清型之間沒有交叉免疫保護作用。現在缺少一種能對臨床樣品中的禽卡氏桿菌進行簡便、快捷、靈敏、準確的試劑盒。
發明內容
本發明的目的是提供一種禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，它可以快速檢測病料中是否含有卡氏桿菌，並且簡便、靈敏、準備。本發明是這樣實現的禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，它包括500 μ 1濃度為25 mg/ ml的蛋白酶K，1500 μ 1裂解液，2000 μ ITE緩衝液，50 μ IPCR酶，200 μ 1超純水，30 μ 1的 Marker DL2000，50 μ 1等體積混合的引物P1，P2，引物P1、P2的濃度均為20 μ M，30 μ 1的陰性對照以及30 μ 1的陽性對照。裂解液為由Tris-base 50mM, EDTA 2 mM，pH為8. 0，以及佔裂解液總體積5%的 triton X-100組成的混合溶液。PCR 酶的組分包括 IOmM 的 Tris-base，50mM 的 KCl、3mM 的 MgCl2、25mM 的 dNTP Mixture 以及 0. 5U 的 Taq DNA polymerase/μ 1。引物Ρ1，Ρ2的序列分別為 陰性對照為去離子水；
陽性對照為重組PMD18-T-16srRNA質粒。PCR方法的建立
PCR體系在25 μ 1反應體系中最佳反應條件為，退火溫度60° C，Taq DNA polymerase 1 U，引物濃度ΙΟμΜ，用引物均有效擴增出了其目的片段，片段大小為780bp。無非特異性片段產生(見圖1)。結果表明禽卡氏桿菌PCR檢測方法建立成功。敏感性試驗
在PCR反應中，10CFU/ml 1 X IO7 CFU/ml稀釋的卡氏桿菌進行PCR，卡氏桿菌的最低檢測量為1000CFU (見圖2)。結果表明建立的PCR敏感性高。特異性試驗
以禽卡氏桿菌血清型1型、2型、4型、豬鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌進行PCR反應。禽卡氏桿菌為陽性，而豬鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、 大腸桿菌的擴增結果均為陰性(見圖3)。應用建立的PCR方法，重複檢測卡氏桿菌DNA樣品3次，結果均一致。從實驗結果可以知道禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒能夠對臨床中禽卡氏桿菌進行快捷、靈敏、準確的檢測。由於採用了上述技術方案，本發明通過對PCR反應條件進行優化，研製了檢測禽卡氏桿菌PCR試劑盒，通過PCR檢測結果與陰性對照及陽性對照比較，可以得到檢測結論， 從而起到快速檢測病料中是否含有禽卡氏桿菌。本發明檢測結果準確，並且快捷、靈敏，檢測方式簡單，使用效果好。
附圖1為禽卡氏桿菌PCR試驗圖；M:DL2000 ；1 禽卡氏桿菌PCR結果。附圖2為禽卡氏桿菌PCR敏感性試驗圖；M :DL2000 ;1 7 :1X107 CFU/ml 10CFU/ml稀釋的禽卡氏桿菌PCR結果。附圖3為PCR特異性試驗圖；M :DL2000 ； 1-3 禽卡氏桿菌1型、2型、4型PCR產物； 4 豬鏈球菌PCR產物；5 多殺性巴氏桿菌PCR產物；6 鼠傷寒沙門氏菌PCR產物；7 大腸桿菌PCR產物。
具體實施例方式
具體實施例方式禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，它包括500μ 1濃度為25 mg/ml 的蛋白酶K，1500 μ 1裂解液，2000 μ ITE緩衝液，TE緩衝液的具體組成成分為"Tris-base 50mM, EDTA 2 mM，pH為8. 0 ；50 μ IPCR酶，PCR酶為自配的PCR預混液，其具體成分為IOmM 的 Tris-base，50mM 的 KCl、3mM 的 MgCl2、25mM 的 dNTP Mixture 以及 0. 5U 的 Taq DNA polymerase/μ 1 ；200 μ 1 超純水，30 μ 1 的 Marker DL2000,50y 1 等體積混合的引物 Pl， P2，引物PI、P2的濃度均為20 μ M，30 μ 1的陰性對照以及30 μ 1的陽性對照。
權利要求
1.一種禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，其特徵在於它包括500 μ 1濃度為25 mg/ml的蛋白酶K，1500 μ 1裂解液，2000 μ ITE緩衝液，50 μ IPCR酶，200 μ 1超純水，30 μ 1的Marker DL2000, 50 μ 1等體積混合的引物Pl，Ρ2，引物PI、Ρ2的濃度均為20 μ Μ，30 μ 1的陰性對照以及30 μ 1的陽性對照。
2.根據權利要求1所述的禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，其特徵在於裂解液為由 Tris-base 50mM, EDTA 2 mM，pH為8. 0，以及佔裂解液總體積5%的triton X-100組成的混合溶液。
3.根據權利要求1所述的禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，其特徵在於PCR酶的組分包括 IOmM 的 Tris-base，50mM 的 KCl、3mM 的 MgCl2、25mM 的 dNTP Mixture 以及 0. 5U 的 iTaq DNA polymerase/μ 1。
4.根據權利要求1所述的禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，其特徵在於引物Pl，Ρ2的序列分別為P1 TTGAAAGCTTGCTTTCAATGC ；P2 :TCGAGAGCCATACCTTTCGTA。
5.根據權利要求1所述的禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，其特徵在於陰性對照為去離子水。
6.根據權利要求1所述的禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，其特徵在於陽性對照為重組 PMD18-T-16srRNA 質粒。
全文摘要
本發明公開了一種禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，它包括500μl濃度為25mg/ml的蛋白酶K，1500μl裂解液，2000μlTE緩衝液，50μlPCR酶，200μl超純水，30μl的MarkerDL2000，50μl等體積混合的引物P1，P2，引物P1、P2的濃度均為20μM，30μl的陰性對照以及30μl的陽性對照。本發明通過對PCR反應條件進行優化，研製了禽卡氏桿菌PCR診斷試劑盒，通過PCR檢測結果與陽性對照和陰性對照比較，得出檢測結論，從而起到快速鑑定菌株中是否含有禽卡氏桿菌溶血素基因。本發明檢測結果準確，並且快捷、靈敏，檢測方法簡單，使用效果確實。
文檔編號C12Q1/68GK102321742SQ201110222208
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月4日 優先權日2011年8月4日
發明者馮惠明, 孫志華, 徐安衡, 李武魁, 楊向東, 楊德明, 許玉清 申請人:雲南瑞特農牧發展有限公司