中華絨螯蟹胚胎超低溫冷凍保存方法
2023-05-09 09:17:21 2
專利名稱：中華絨螯蟹胚胎超低溫冷凍保存方法
技術領域：
本發明涉及中華絨螯蟹胚胎低溫保存技術。
背景技術：
中華絨螯蟹作為重要的甲殼動物經濟品種，在我國水產養殖業中佔據重要的經濟地位。近年來，由於過度捕撈、不合理漁具運用等導致中華絨螯蟹種質資源衰退，生物多樣性和遺傳多樣性減少，開展中華絨螯蟹胚胎的超低溫冷凍保存研究對於優良種質的保護開發、資源的增殖放流以及進行商業化養殖具有重要意義。目前對於哺乳動物和脊椎動物胚胎的超低溫冷凍保存已有成功報導，但對於無脊椎動物胚胎的冷凍保存仍存在許多關鍵技術瓶頸，還未見甲殼動物胚胎超低溫冷凍保存成功的報導。
發明內容
本發明需要解決的問題是創造一種超低溫冷凍保存中華絨螯蟹胚胎的方法。本發明的技術方案選取中華絨螯蟹前無節幼體期或原潘狀幼體期的胚胎，前無節幼體期胚胎在濃度30%的I，2-丙二醇+20%二甲基甲醯胺為玻璃化液中平衡40min，然後在-20°C冰瓶中平衡lmin，再在液氮口平衡Imin後直接投入液氮中，前無節幼體期胚胎經過40min冷凍後，快速提至液氮口平衡Imin，再快速放入38°C水浴中解凍，經0.25mol/L蔗糖洗脫lOmin，將前無節幼體期胚胎放在鹽度15的海水中培養；或採用原潘狀幼體期胚胎在濃度30%的1，2_丙二醇+20%二甲基甲醯胺為玻璃化液中平衡40min，然後在_20°C冰瓶中平衡lmin， 再在液氮口平衡Imin後直接投入液氮中，原潘狀幼體期胚胎經過35min冷凍後，快速提至液氮 口平衡Imin後，再快速放入38°C水浴中解凍，經0.25mol/L蔗糖洗脫lOmin，再將原潘狀幼體期胚胎放在鹽度15的海水中培養。本發明的突出特點是創造了一種甲殼動物胚胎超低溫冷凍保存的方法，首次成功保存了中華絨螯蟹胚胎，並獲得了出膜幼體，達到國際領先。
具體實施例方式本發明通過在中華絨螯蟹繁殖季節，採集中華絨螯蟹抱卵蟹，從抱卵蟹上小心剝離受精卵，分別取5個不同時期的胚胎(細胞分裂期、囊胚期、原腸期、前無節幼體期和原潘狀幼體期)作為研究對象，將這5個時期的胚胎分別放入三種不同濃度(10^^15^^20%)的4種抗凍劑(二甲亞碸、甲醇、1，2_丙二醇、二甲基甲醯胺)中平衡30min後，觀察胚胎成活率，確立了中華絨螯蟹適宜保存的胚胎發育時期為前無節幼體期和原潘狀幼體期，篩選出了適宜保存的抗凍劑為1，2-丙二醇和二甲基甲醯胺，在此研究基礎上，對4種單因子抗凍劑按照一定濃度進行組合，形成6種玻璃化液，將不同時期胚胎放入6種玻璃化液中分別按照二步平衡法、三步平衡法和五步平衡法平衡40min，其中(I) 二步法，用鹽度15的海水將玻璃化液稀釋成1/2的濃度，每個時期的胚胎在1/2濃度和玻璃化液中分別平衡20min ；(2)三步法，用鹽度15的海水將玻璃化液分別稀釋成1/4和1/2的濃度，每個時期的胚胎在1/4、1/2濃度和玻璃化液中各平衡約13min ;(3)五步法，用鹽度15的海水將玻璃化液分別稀釋成1/4、1/3、1/2和2/3的濃度，每個時期的胚胎在各稀釋濃度和玻璃化液中逐次平衡8min。胚胎經不同方法平衡後觀察成活率情況，確立30% I，2-丙二醇+20% 二甲基甲醯胺為最佳玻璃化液配方，五步平衡法為最佳平衡方法。將前無節幼體期胚胎在該玻璃化液中採用五步法平衡40min，然後在-20°C冰瓶中平衡lmin，再在液氮口平衡Imin後直接投入液氮中，經過40min冷凍後，將胚胎快速提至液氮口平衡Imin後，再快速放入38°C水浴中解凍，經0.25mol/L蔗糖洗脫lOmin，將胚胎放在鹽度15的海水中培養，胚胎成活率為9.3±2.5% ;將原潘狀幼體期胚胎在上述玻璃化液中採用五步法平衡40min，然後在_20°C冰瓶中平衡lmin，再在液氮口平衡lmin後直接投入液氮中，經過35min冷凍後，將胚胎快速提至液氮口平衡Imin後，再快速放入38°C水浴中解凍，經0.25mol/L蔗糖洗脫lOmin，將胚胎放在鹽度15的海水中培養，胚胎成活率為11.3±3.6%，培養至第7天，胚胎完全孵化出膜。`
權利要求
1.中華絨螯蟹胚胎超低溫冷凍保存方法，其特徵是選取中華絨螯蟹前無節幼體期或原潘狀幼體期的胚胎，前無節幼體期胚胎在濃度30%的1，2_丙二醇+20%二甲基甲醯胺為玻璃化液中平衡40min，然後在_20°C冰瓶中平衡lmin，再在液氮口平衡Imin後直接投入液氮中，前無節幼體期胚胎經過40min冷凍後，快速提至液氮口平衡Imin，再快速放入38°C水浴中解凍，經0.25mol/L蔗糖洗脫lOmin，將前無節幼體期胚胎放在鹽度15的海水中培養；或採用原潘狀幼體期胚胎在濃度30%的1，2_丙二醇+20%二甲基甲醯胺為玻璃化液中平衡40min，然後在-20°C冰瓶中平衡lmin，再在液氮口平衡Imin後直接投入液氮中，原潘狀幼體期胚胎經過35min冷凍後，快速提至液氮口平衡Imin後，再快速放入38°C水浴中解凍，經0.25mol/L蔗糖洗 脫lOmin，再將原潘狀幼體期胚胎放在鹽度15的海水中培養。
全文摘要
中華絨螯蟹胚胎超低溫冷凍保存方法，其特徵是取中華絨螯蟹的前無節幼體期胚胎在30％的1，2-丙二醇+20％二甲基甲醯胺為玻璃化液中平衡40min，在-20℃冰瓶中平衡1min，在液氮口平衡1min後投入液氮中，經40min冷凍後，將胚胎快速提至液氮口平衡1min，再快速放入38℃水浴中解凍，經0.25mol/L蔗糖洗脫10min，前無節幼體期胚胎放在鹽度15的海水中培養；取中華絨螯蟹的原溞狀幼體期胚胎在玻璃化液中平衡40min，在-20℃冰瓶中平衡1min，再在液氮口平衡1min後投入液氮中，經35min冷凍後，將胚胎快速提至液氮口平衡1min後，再快速放入38℃水浴中解凍，經0.25mol/L蔗糖洗脫10min，原溞狀幼體期胚胎放在鹽度15的海水中培養。
文檔編號A01N1/02GK103098792SQ20111035508
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月10日 優先權日2011年11月10日
發明者黃曉榮, 章龍珍, 莊平, 馮廣朋, 劉鑑毅, 張濤, 趙峰 申請人:中國水產科學研究院東海水產研究所