同一比色池測定葡萄糖及1,5－脫水葡萄糖醇的方法
2023-05-09 17:29:06 4
專利名稱：同一比色池測定葡萄糖及1,5－脫水葡萄糖醇的方法
技術領域：
本發明屬於生命科學一臨床化學領域，涉及在同一比色池測定葡萄糖及1，5-脫水葡萄糖醇測定1，5-脫水葡萄糖醇。
背景技術：
血清中糖醇類物質主要是葡萄糖(Glu)和1，5-脫水葡萄糖醇(1，5-AG)。1，5-AG是呋喃葡萄糖的C1-脫氧形式，主要來源於食物，它存在於人的腦脊液、血清中，在體內形成穩定的貯存池，血清中其含量在多元糖醇類物質中僅次於Glu。糖尿病時隨著血糖濃度的升高，腎小管重吸收1，5-AG能力下降導致血清中1，5-AG含量明顯下降。研究表明，血清1，5-AG檢測作為篩選糖尿病的隨機實驗比其他評價實驗更為靈敏。而1，5-AG的測定方法雖多，如色譜法、全自動連續注射系統-酶測定法和微柱酶法，但均需昂貴的專用儀器，操作繁瑣，不適合於臨床常規檢驗。1994年Fukumura建立了全酶法[4]測定血清1，5-AG。全酶法是1，5-AG最簡便的測定方法，但首先要去除血清內源性Glu的幹擾。葡萄糖測定的常規方法是Glu在葡萄糖氧化酶(GOD)作用下生成葡萄糖酸和過氧化氫(H2O2)，後者與酚及4-AAP在過氧化物酶(POD)作用下生成紅色醌類化合物，可在500nm處檢測，其顏色的深淺與葡萄糖含量成正比。這兩種物質在國外是檢測糖尿病的常規指標，分開測定成本很高，如酶法測定1，5-AG須去除血清葡萄糖的幹擾(而又沒有測定葡萄糖著實存在浪費)。
發明內容
為了降低測定葡萄糖、1，5-脫水葡萄糖醇的成本，充分利用全酶法測定1，5-脫水葡萄糖醇的中間環節，本發明提出同一比色池測定葡萄糖及1，5-脫水葡萄糖醇的方法。
技術方案為同一比色池測定葡萄糖及1，5-脫水葡萄糖醇的方法，步驟如下首先用三羥甲基氨基甲烷和鹽酸組成的緩衝溶液處理血清，經由GK和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶偶聯繫統將血清中葡萄糖徹底轉化為不與PROD反應的6-磷酸葡萄糖酸內酯，以除去內源性Glu的幹擾，同時並測定吸光變化以測定葡萄糖含量；然後加濃度為200mmol/L的N-2-羥乙基哌嗪N′-2-乙烷磺酸溶液，把被測的1，5-脫水葡萄糖醇氧化成1，5-脫水果糖和H2O2，H2O2釋放出新生態的氧將與HRP、4-AAP和HTIB反應系統作用發生Trinders顯色反應後進行比色測定1，5-脫水葡萄糖醇的含量。
有益效果本方法將酶促反應的高特異性和的高靈敏性結合起來，建立了一種在同一比色池對葡萄糖和1，5-脫水葡萄糖醇檢測的方法。該方法具有靈敏、準確、穩定、特異性等特點，可自動化同時檢測葡萄糖和1，5-脫水葡萄糖，降低了檢測成本，為糖尿病的檢測與治療監控提供了新的方法。
具體實施例方式
材料與方法1.試劑(1)試劑I(RI)三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩衝溶液(Tris/HCl)內含葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)，辣根過氧化物酶(HRP)。(2)試劑II(RII) N-2-羥乙基哌嗪N′-2-乙烷磺酸溶液(HEPES)內含呋喃糖氧化酶(PROD)，抗壞血酸氧化酶(AO)，3-羥基-2、4、6-三碘苯甲酸(HTIB，)。(3)標準液50mmol/L的Glu標準液和1mmol/L的1，5-AG標準液。
2.儀器RA1000(Technicon，美國)，Hitachi 7080全自動生化分析儀(日立，日本)。
3.方法(1)方法原理首先用RI處理血清，經由GK和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)偶聯繫統將血清中Glu徹底轉化為不與PROD反應的6-磷酸葡萄糖酸內酯(6-PGA)，以除去內源性Glu的幹擾並測定吸光變化以計算Glu含量。加入試劑RII後，1，5-AG被氧化成1，5-脫水果糖和H2O2，後者經HRP、4-AAP和HTIB反應系統作用發生Trinders顯色反應後進行比色測定，反應式如下 +4-AAP+HTIB→4-AAP-HTIB(有色物)(2)參數設置上機參數Glu測定終點法參數，溫度37℃，主波長340nm，副波長405nm，RI300μl溫5min讀吸光度A1，加入樣品10μl，反應10min，測定吸光度A2。將主波長調至540nm，副波長700nm，加入RII 150μl，讀取吸光度A3，反應5min，讀取吸光度A4，空白調零。手工測試參數除上述基本參數外，樣品和試劑量按比例增減。
計算公式Glu(mmol/L)＝(A2-A1)×標準品濃度/(A標2-A標1)。
1，5-AG(μmol/L)＝(A4-A3)×標準品濃度/(A標4-A標3)。
討論目前在國外尤其是日本，Glu與1，5-AG是診斷與監控糖尿病近期治療的最重要的指標。國際上推薦的Glu參考方法是HK法，而1，5-AG的測定方法中以微柱酶法和Fukumura的全酶GK和PK-PEP系統最為簡便和可靠。我們首次用GK和G-6PD偶聯繫統去除內源性Glu並同時測定Glu的濃度，然後在同一比色池中加入含PROD的試劑改變主副波長，引入Trinder反應系統以測定1，5-AG的濃度。本方法將酶促反應的高特異性和的高靈敏性結合起來，建立了一種新全酶法對Glu和1，5-AG同時檢測的自動化分析方法。本研究結果表明，該方法具有靈敏、準確、穩定、特異性等特點。二種指標的線性範圍足以滿足臨床對糖尿病的篩檢及治療監控要求。
我們對建立的方法進行了方法學評價。Glu在0.2～40mmol/L內線性良好，若高於該值建議稀釋後重新測定；1，5-AG的測定範圍為2.1～550μmol/L。本方法的精密度與準確度符合RCV的要求。二者批內CV％均在2％以內、批間均3％以內；本法的測定Glu和1，5-AG的平均回收率分別為100.2％和101.7％。由於人類血清/血漿中糖醇類物質主要是Glu和1，5-AG。其它如麥芽糖、乳糖含量極微。常規條件下的高血脂、輕微溶血和高膽紅素對Glu和1，5-AG的測定影響甚微。用本法測定Glu和1，5-AG分別與HK法和Lana微柱法相關性甚好。
權利要求
1.同一比色池測定葡萄糖及1，5-脫水葡萄糖醇的方法，步驟如下首先用三羥甲基氨基甲烷和鹽酸組成的緩衝溶液處理血清，經由GK和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶偶聯繫統將血清中葡萄糖徹底轉化為不與PROD反應的6-磷酸葡萄糖酸內酯，以除去內源性Glu的幹擾，同時並測定吸光變化以測定葡萄糖含量；然後加濃度為200mmol/L的N-2-羥乙基哌嗪N′-2-乙烷磺酸溶液，把被測的1，5-脫水葡萄糖醇氧化成1，5-脫水果糖和H2O2，H2O2釋放出新生態的氧將與HRP、4-AAP和HTIB反應系統作用發生Trinders顯色反應後進行比色測定1，5-脫水葡萄糖醇的含量。
全文摘要
本發明提出了同一比色池測定葡萄糖及1，5－脫水葡萄糖醇的方法，具體為首先用三羥甲基氨基甲烷和鹽酸組成的緩衝溶液處理血清，經由GK和葡萄糖－6－磷酸脫氫酶偶聯繫統將血清中葡萄糖徹底轉化為不與PROD反應的6－磷酸葡萄糖酸內酯，以除去內源性葡萄糖的幹擾，同時並測定吸光變化以測定葡萄糖含量；然後加濃度為200mmol/L的N－2－羥乙基哌嗪N′－2－乙烷磺酸溶液，把被測的1，5－脫水葡萄糖醇氧化成1，5－脫水果糖和H
文檔編號C12Q1/54GK101071105SQ200710052479
公開日2007年11月14日 申請日期2007年6月12日 優先權日2007年6月12日
發明者馮景 申請人:馮景