一種檢測內毒素的方法

2023-05-09 09:36:21

專利名稱：一種檢測內毒素的方法
技術領域：
本發明涉及ー種內毒素的檢測方法，特別涉及ー種內毒素的電化學檢測方法。
背景技術：
所有能引起熱原反應的物質稱為熱原，藥品中的熱原主要是細菌內毒素。半個多世紀以來，熱原檢查法對保證注射用藥品安全發揮了重要作用。但隨著製藥エ業的發展，該方法已不完全適合許多品種的熱原檢查。為此，人們研究了ー種替代熱原檢查法的方法，這就是我們今天正在研究和擴大應用的細菌內毒素檢查法。細菌內毒素檢查是輸注藥品及器械質量控制中的ー項重要指標。內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分之一，革蘭氏陰性菌破裂後，釋放出內毒素，環境中內毒素無處不在，具有廣泛的生物活性，以致熱居首。防止輸注用藥及器械的熱原汙染，是十分重要的。目前檢測內毒素的主要試劑是鱟試劑，基於鱟試劑的檢測方法包括凝膠法、顯色 法和濁度法。內毒素與鱟試劑接觸後，能引發一系列的級聯反應，最終激活鱟試劑中的凝固酶原，從而導致鱟試劑的凝固。凝膠法用於定性測試，顯色法和濁度法可以用於內毒素的定量測定。顯色法和濁度法實驗過程中都需要分光光度計，用時1-2小時，檢測容易受到樣品中顯色物質的幹擾，而且鱟試劑的凝固過程對光學測量有一定幹擾，因此難以實現對內毒素的精確檢測。

發明內容
本發明的目的在於提供一種檢測內毒素的新方法，其能實現對內毒素的快速、精確檢測，從而克服了現有技術中的不足。為實現上述發明目的，本發明採用的一種檢測內毒素的方法包括
在鱟試劑中加入具有氧化還原活性的物質，再向鱟試劑中加入可能含有內毒素的待測樣品，並對鱟試劑施加與所述具有氧化還原活性的物質相應的氧化還原電位，同時實時監測通過鱟試劑的電流大小，進而獲知待測樣品中內毒素的濃度；
其中，加入所述鱟試劑中的內毒素濃度與通過鱟試劑的電流的驟降時間點之間存在如下對數線性關係logT=klogC+h,其中T為電流驟降時間，C為內毒素的濃度，k為直線斜率，h為Y軸截距，更確切的講，k和h為與鱟試劑種類和濃度相關的常數。作為較佳的實施方案之一，加入所述鱟試劑中的具有氧化還原活性的物質的濃度為0. I 100 mM，尤其優選為1-50 mM。作為較佳的實施方案之一，所述氧化還原電位的大小為-I. OV +1. 0V。作為可實施的方案之一，所述具有氧化還原活性的物質可選自鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、釕或其配合物(六氨合釕等)、吩惡嗪衍生物(8- ニ甲基氨-2，3-苯並吩惡嗪、7- ニ甲基氨-1，2-苯並吩惡嗪等)，但不限於此。作為可實施的方案之一，所述鱟試劑可選自商品化凝膠法、濁度法、顯色法鱟試齊U，但不限於此。
進ー步的，該方法還可包括如下步驟
在鱟試劑中加入具有氧化還原活性的物質，並將鱟試劑的溫度調整至設定值，再向鱟試劑中分別加入一系列具有不同濃度的內毒素標準樣品，且保持所述鱟試劑溫度不變，並向所述鱟試劑施加與所述具有氧化還原活性的物質相應的氧化還原電位，同時實時監測通過鱟試劑的電流大小，進而繪製內毒素濃度-電流驟降時間點標準曲線，並得出加入所述鱟試劑中的內毒素濃度與通過鱟試劑的電流的驟降時間點之間的對數線性關係。作為較佳的實施方案之一，該方法是在溫度為37. 0±1°C的條件下進行的。與現有技術相比，本發明的優點至少在於通過電化學過程直接反應出鱟試劑凝固過程中粘度的改變，不受樣品顏色的幹擾，使用相同的鱟試劑，採用本發明方法完成檢測用時比顯色法與濁度法減少10-25%，能快速、精確的實現對內毒素的檢測，檢測靈敏度可達 0.01 EU/ml適於在藥品質量控制、醫療器械熱原監測等領域廣泛應用。


圖I是本發明內毒素檢測方法的工作原理示意圖，其中，內毒素引發鱟試劑的級聯反應，導致鱟試劑聚集形成凝膠，且聚集過程中導致穩態電流急劇降低。圖2a和圖2b分別是本發明一典型實施例中的時間-電流曲線圖和對應的標準曲線圖，在圖2a中，從右到左所示曲線分別對應濃度為0. 05,0. 1,0. 2,0. 5、1、2、5、10 Eu mじ1的內毒素，標準曲線如圖2b所示，其中實驗中實際測得的時間電流曲線100秒時的電流在圖2a中被定義為I。圖3a是以傳統濁度法所獲時間-吸光度曲線圖，圖3b所示系以傳統濁度法和本發明一典型實施例中內毒素檢測方法所獲標準曲線對照圖，在圖3a中從右到左所示曲線分別對應濃度為0. 1、0. 2、0. 5、1、2、5、10 Eu mじ1的內毒素，在圖3b中上下兩條標準曲線分別對應傳統濁度法和本發明的結果。
具體實施例方式如前所述，有鑑於現有技術中的諸多不足，本發明g在提供ー種新型的基於電化學的檢測鱟試劑凝固過程的方法用於內毒素的測定。概括的講，本發明是通過電化學過程直接反應出鱟試劑凝固過程中粘度的改變，進而實現對樣品中所含內毒素的檢測，且檢測結果不會受到樣品顏色的幹擾，檢測精確度好、時間短。更為具體的講，參閱圖1，本發明通過在鱟試劑中加入具有氧化還原活性的物質(如鐵氰化鉀、釕等)，對鱟試劑施加氧化還原電位，即可利用電化學工作站或者其他檢測設備，檢測到電流信號隨時間的改變，該電流在不加入內毒素時是ー個穩態電流(圖I下端左側曲線所示)。而當內毒素加入後，會引發鱟試劑的凝固反應，使體系的粘度増加，並阻礙氧化還原物質與電極之間的電子傳遞，這ー過程打破了電流的穩態，電流會出現ー個急劇的減小過程(圖I下端右側曲線所示)。不同濃度的內毒素加入體系後，引發鱟試劑凝固的快慢是不一樣的，對應不同的電流急劇減小時刻，並且，本案發明人還發現，內毒素的濃度與內毒素引起的電流驟降時間點之間存在對數線性關係，因此利用本發明方法可以實現內毒素的快速精確檢測。
作為本發明的一個較優實施方案，其所涉及的內毒素的檢測方法可以包括如下步驟
(1)選取市售的任ー種商品化凝膠法、濁度法或顯色法鱟試劑備用；
(2)選取本領域習用的鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、釕或其配合物(六氨合釕等)、吩惡嗪衍生物(8- ニ甲基氨-2，3-苯並吩惡嗪、7- ニ甲基氨-1，2-苯並吩惡嗪等)中的任意ー種作為具有氧化還原活性的物質備用；
(3)將所述具有氧化還原活性的物質加入前述鱟試劑中，優選使得其中具有氧化還原活性的物質的濃度達到0. 1-lOOmM，並且，進ー步優選的，還可將形成的混合物預熱至設定溫度 37. 0±1°C ；
(4)再向前述鱟試劑中加入內毒素標準品或者待測樣品，並插入電極，向鱟試劑施加與前述具有氧化還原活性的物質對應的氧化還原電位(一般為-I. OV +1. 0V),並實時監測通過該混合體系的電流，電流將在一定時間後(大約30s)進入穩態，即以較穩定的速度緩慢 下降，當鱟試劑在內毒素引發下而發生凝固吋，穩態打破，電流急劇減小。為確切探知加入鱟試劑中的內毒素濃度與通過鱟試劑的電流的驟降時間點之間的關係，以下僅結合一典型實施例及相應附圖作更為詳細的說明
本實施例中內毒素的檢測方法包括
取30 ii L 50 mM Fe (CN)廣、150 y L LAL試劑、120 y L含有不同濃度內毒素的樣品均勻混合，並將形成的混合體系的溫度調整至37. 0±1°C，再以碳電極作為工作電極、Ag/AgCl電極作為參比電極、鉬電極作為對電極插入該混合體系中，構建三電極電化學體系，其後，以CHI 660D電化學工作站(產自CH設備公司，中國上海)配合前述電化學體系進行試驗，其中，測試電壓恆定為-0. 3V。前述樣品可採用濃度分別為0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、1、2、5、10 Eu mじ1的一系列內
毒素標準樣品。藉由這些標準樣品，可以獲得如圖2a所示時間-電流曲線圖譜，而根據該圖譜，還繪製了如圖2b所示標準曲線。參照該圖2b，顯然可以看到，加入所述鱟試劑中的內毒素濃度與通過鱟試劑的電流的驟降時間點之間存在對數線性關係，線性回歸方程為1=2. 935-0. 3600x, R2=O. 9942，其中y是凝固開始時間的對數值，x是內毒素濃度的對數值。又及，本案發明人還採用與本實施例相同的鱟試劑，利用傳統濁度法對濃度分別為0. 1、0. 2、0. 5、1、2、5、10 Eu mじ1的一系列內毒素標準樣品進行了檢測，並獲得如圖3a所示時間-吸光度曲線圖譜，並藉由該時間-吸光度曲線圖譜繪製了相應的標準曲線(參閱圖3b中所示位於上方的曲線),並將之與本實施例所獲的前述標準曲線(參閱圖3b中所示位於下方的曲線)進行了對比，顯然，可以看到，藉由本實施例的內毒素檢測方法，可以更為精確快捷的實現對內毒素的檢測，且完成同樣靈敏度的內毒素測試，本發明方法耗時較之傳統方法減少10-25%。進ー步，顯然，若要對待測樣品中的內毒素濃度進行檢測，則只需按照本實施例所示的方法進行操作，井根據最終所獲通過鱟試劑的電流的驟降時間點等數據及前述圖2b所示標準曲線，即可獲知待測樣品中的內毒素濃度。例如，本案發明人曾以含有10%牛血清蛋白的細胞培養介質進行了試驗，在應用所述細胞培養介質培養細胞2天之後，向該細胞培養介質中分別加入不同數量的內毒素，並分別以本發明前述實施例的方法(以下簡稱「本發明方法」)及傳統濁度法進行了測試，其結果參見下表I:
表I以本發明方法和傳統濁度法對細胞培養介質中的內毒素進行的測試結果
權利要求
1.一種檢測內毒素的方法，其特徵在於，它包括 在鱟試劑中加入具有氧化還原活性的物質，再向鱟試劑中加入可能含有內毒素的待測樣品，並對鱟試劑施加與所述具有氧化還原活性的物質相應的氧化還原電位，同時實時監測通過鱟試劑的電流大小，進而獲知待測樣品中內毒素的濃度； 其中，加入所述鱟試劑中的內毒素濃度與通過鱟試劑的電流的驟降時間點之間存在如下對數線性關係logT=klogC+h，其中T為電流驟降時間，C為內毒素的濃度，k和h為與鱟試劑種類和濃度相關的常數。
2.根據權利要求I所述的檢測內毒素的方法，其特徵在於，加入所述鱟試劑中的具有氧化還原活性的物質的濃度為0. I 100 mM。
3.根據權利要求I或2所述的檢測內毒素的方法，其特徵在於，加入所述鱟試劑中的具有氧化還原活性的物質的濃度為1-50 mM。
4.根據權利要求I所述的檢測內毒素的方法，其特徵在於，所述氧化還原電位的大小為-I. OV +1.0V。
5.根據權利要求I中任一項所述的檢測內毒素的方法，其特徵在於，所述具有氧化還原活性的物質至少選自鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、釕或其配合物和吩惡嗪衍生物中的任意一種。
6.根據權利要求5所述的檢測內毒素的方法，其特徵在於，所述釕的配合物包括六氨合釕，所述吩惡嗪衍生物包括8- ニ甲基氨-2，3-苯並吩惡嗪和/或7- ニ甲基氨-1，2-苯並吩惡嗪。
7.根據權利要求I所述的檢測內毒素的方法，其特徵在於，所述鱟試劑至少選自商品化凝膠法、濁度法、顯色法鱟試劑中的任意ー種。
8.根據權利要求I所述的檢測內毒素的方法，其特徵在於，該方法還包括如下步驟 在鱟試劑中加入具有氧化還原活性的物質，並將鱟試劑的溫度調整至設定值，再向鱟試劑中分別加入一系列具有不同濃度的內毒素標準樣品，且保持所述鱟試劑溫度不變，並向所述鱟試劑施加與所述具有氧化還原活性的物質相應的氧化還原電位，同時實時監測通過鱟試劑的電流大小，進而繪製內毒素濃度-電流驟降時間點標準曲線，並得出加入所述鱟試劑中的內毒素濃度與通過鱟試劑的電流的驟降時間點之間的對數線性關係。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的檢測內毒素的方法，其特徵在於，該方法是在溫度為37. 0±1°C的條件下進行的。
全文摘要
本發明公開了一種檢測內毒素的方法，包括在鱟試劑中加入具有氧化還原活性的物質，再向鱟試劑中加入可能含有內毒素的待測樣品，並對鱟試劑施加與所述具有氧化還原活性的物質相應的氧化還原電位，同時實時監測通過鱟試劑的電流大小，進而獲知待測樣品中內毒素的濃度；其中，加入所述鱟試劑中的內毒素濃度與通過鱟試劑的電流的驟降時間點之間存在對數線性關係。本發明通過電化學過程直接反應出鱟試劑凝固過程中粘度的改變，不受樣品顏色的幹擾，能快速、精確的實現對內毒素的檢測，適於在藥品質量控制、醫療器械熱原監測等領域廣泛應用。
文檔編號G01N27/26GK102866187SQ20121039667
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月18日 優先權日2012年10月18日
發明者劉濤, 繆鵬, 張春, 祁靜, 韓坤 申請人:蘇州生物醫學工程技術研究所