源於桉樹的增加植物生物量的基因、重組表達載體和應用的製作方法

2023-05-24 00:27:46

專利名稱：源於桉樹的增加植物生物量的基因、重組表達載體和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因及編碼蛋白與應用領域，特別是涉及源於桉樹的WPGS3基因和WPGS4基因及其編碼蛋白與其在提高植物生物量的應用。
背景技術：
桉樹是桃金孃科(Myrtaceae)桉樹屬(Eucalyptus)的總稱,是一種集觀賞、用材、紙漿原料、藥用於一體的優良樹種。由於林木生長周期長，遺傳雜和性高，許多性狀屬於多基因控制的數量性狀，常規的育種手段難以滿足定向培育桉樹新品種的要求，因此人們將研究重點及成功希望寄託於基因工程技術來解決桉樹常規育種難以解決的問題，加速優質、聞廣按樹新品種的選育進程。林木等木本植物基因資源豐富，但許多天然優良基因尚未被分離利用，大部分基因的功能仍處於未知的狀態。因此，研究桉樹中能增加生物量的基因可為進一步進行基因工程改造、獲得高產量的優良樹種奠定基礎，具有重要意義。目前對林木基因的分離及功能鑑定主要通過與模式植物擬南芥或菸草等的同源基因進行相似性比較，建立進化樹，運用反向遺傳學方法，通過調控基因表達如過表達或基因沉默等技術研究基因的功能。蘇曉華等(2009)從美洲黑楊中分離得到MADS-box基因PdPl,並在菸草中過表達，導致其提前開花。李海霞等(2009)將毛白楊的PtDRGOl基因導入菸草，轉基因植株的菸草花葉病毒蘇亮顯著少於對照，表明該基因具有抗病毒功能。Sonoda等將赤桉HD-Zip class II轉錄因子EcHBl基因轉入菸草，轉基因植株纖維長度和乾重增力口，葉片、根和莖的生長量均高於對照。GRF1，全稱為生長調節因子1，是GRF家族中的一員。目前已經在擬南芥、大麥、小麥以及水稻等植物中鑑定分離到該基因並證實其調節植物生長的功能。水稻中的OsGRFl具有調節莖伸長的功能，而在擬南芥中過表達AtGRFl及AtGRF2會導致葉片及子葉增大。然而目前為止對林木中GRF基因的分離和鑑定還是空白。EBPl，全稱為ErhB3-結合蛋白，經證明是一種和人類基因EBPl同源的植物生長調控基因。Beatrics等首次在番茄和擬南芥中發現該基因並證實該基因在器官發育早期能促進細胞增殖，改變細胞分裂的臨界大小並且縮短有絲分裂的時間，在有絲分裂後期促進細胞的擴張。擬南芥EBPl的過表達會使葉片顯著增大。然而對林木EBPl基因的研究和應用還有待進行。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是，從桉樹中克隆出兩個和增加植物生物量有關的基、因WPGS3與WPGS4，並轉入擬南芥驗證其功能，從而為該基因進一步應用於林木的基因改造
奠定基礎。本發明另一個所要解決的技術問題是，提供上述基因的重組表達載體。本發明又一個所要解決的技術問題是，提供應用上述基因的增加生物量的方法。本發明通過對桉樹的RNA進行深度測序得到桉樹全長cDNA文庫，然後NCBIgenebank中查找到AtGRFl和AtEBPl編碼蛋白的胺基酸序列，並和桉樹的全長cDNA文庫進行序列相似性比對(tBLASTn)，得到桉樹中的GRFl和EBPl的cDNA序列(SEQ ID NO: 3, SEQID NO: 4)，並命名為 WPGS3 (WPGS 是 Ioody Plant Growth Stimulator 的首字母縮寫)和WPGS4。其中WPGS3基因長度為783bp，其編碼的蛋白序列為SEQ ID NO: 1，含有260個胺基酸，和AtGRFl蛋白的序列相似度達到94%，而WPGS4基因長度為987bp，編碼328個胺基酸，序列為SEQ ID NO: 2，和擬南芥EBPl蛋白的序列相似度為84%。本發明提供源於桉樹的增加植物生物量的基因，包括WPGS3基因與WPGS4基因，所述WPGS3基因的cDNAs是下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQID NO: 3的DNA序列；
2)編碼序列表中SEQID NO: I的胺基酸酸序列；
而所述WPGS4基因的cDNA是下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQID N0:4的DNA序列；
2)編碼序列表中SEQID NO:2的胺基酸酸序列。 本發明還提供一種重組表達載體，用於表達WPGS3基因或WPGS4基因，該重組表達載體至少包括上述的基因。進一步地,該重組表達載體為pEUV (Eucalyptus Vector)。本發明還提供一種提高植物生物量的方法，將上述的增加植物生物量的基因導入植物組織，細胞或器官，促使植物生物量獲得提高。進一步地，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。本發明的目的是提供一種提高植物生物量的方法。本發明所提供的提高植物生物量的方法，是將桉樹的WPGS3基因和WPGS4基因用已知方法進行分離，修飾和設計所得。分離出來的WPGS3基因和WPGS4基因在分離後插入pEUV載體，利用二元載體，經農桿菌侵染加插於擬南芥的種子中，利用椰菜花葉病毒35S啟動子，令其過量表達，從而使植物生物量增加的表現型。利用35S啟動子令載體上的基因過表達，使植物的生物量比野生種的植物在相同種植環境下得到提升。詳細步驟參考具體實施方式
。本發明具有如下有益效果本發明提供了一個來源於桉樹的WPGS3基因及其編碼蛋白。轉基因實驗證明，WPGS3基因的過表達株系能夠增加生長因子的轉錄，增加葉片與子葉的大小。其母葉與子葉的大小顯著高於野生型，因此在同樣的生長環境及生長時間下，WPGS3基因的過表達株系能產生更高生物量，提高植物生物量產量。本發明亦提供了一個來源於桉樹的WPGS4基因。其編碼蛋白ErbB3_結合蛋白I、是一種植物生長調控基因，無論功能上或結構上都跟人類WPGS4同源。在器官成長的早期過程中，WPGS4能促進細胞擴增，影響細胞分裂時的細胞大小及縮短組織分化時間。轉基因實驗證明，WPGS4的過表達植物比其野生型植物的葉盤直徑顯著增加，令其在相同的生長環境及生長時間下，比野生型植物有更高的生物量產量。


圖IA是pEUV-WPGS3的載體資料示意圖，35S代表椰菜花葉病毒35S啟動子，D35S代表出去TATA序列椰菜花葉病毒35S啟動子。
圖IB是pEUV-WPGS4的載體資料示意圖，35S代表椰菜花葉病毒35S啟動子，D35S代表出去TATA序列椰菜花葉病毒35S啟動子。 圖2A是WPGS3過表達突變株DNA鑑定。圖2B是WPGS4過表達突變株DNA鑑定。圖3A是WPGS3過表達系的T2代和野生型植株的照片，可見轉基因植物的葉片明
顯增大。圖3B是WPGS3過表達系的T2代和野生種在播種後17天，20天，27天葉盤直徑的比較曲線圖，樣本數量>10, t test中，P〈0. 01。圖4A是WPGS3過表達系的T2代和參照Col O (Columbia O)在播種後34天的照片，可見轉基因植物的高度明顯高於野生型植物。圖4B是WPGS3過表達系的T2代和參照Col O (Columbia O)在播種後34天的高度比較圖，樣本數量>10，在t test中，P值〈O. 01。圖5A是在擬南芥中，WPGS4過表達系T2代和野生種在播種後41天的照片，可見轉基因植物的葉片明顯增大。圖5B是WPGS4過表達系(左)和野生種在播種後41天的葉片直徑比較圖，誤差線代表標準方差。在t test中，P值〈O. 01。
具體實施例方式下面通過具體實施例並參照附圖對本發明進行更詳細的說明。應該理解的是，以下所述的實施例僅是用於說明而不是限制本發明。一、桉樹的cDNA的製備
以Guo at al. 2008所採用的方法選取新鮮的桉樹(Eucalyptus urophylla xgrandis cv DH32-29)葉片和花瓣，放入液氮中冰凍，然後放入_80°C冰箱中保存備用。使用十六燒基三甲基溴化胺(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide, CTAB)法提取組織總RNA，具體實施1)65°C水浴中預熱15 ml CTAB提取液；2)液氮中研磨2_3克桉樹冷凍組織；3)轉移樣品至有CTAB提取液的離心管中，立即在室溫下以10(Γ300轉/分鐘的轉速激烈渦旋30s，然後65°C水浴4-5分鐘；4)加入等體積的氯仿/異戊醇，渦旋混合，10000轉/分鐘常溫離心15分鐘；5)將上清轉移至一新的離心管中，重複抽提一次；6)將上清轉移至一新的離心管中，加入1/3體積的氯化鋰，至終濃度為2 M，4°C沉澱過夜；7)4°C全速離心(轉速為1000(Tl5000轉/分鐘，下同)1小時，棄上清，用500 μ I 70%乙醇洗沉澱，然後用500 μ I 100%乙醇洗沉澱；8)用500 μ I SSTE溶解沉澱，轉移至I. 5 ml離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇抽提一次；9)加入2倍體積的無水乙醇，在_70°C沉澱30分鐘或_20°C沉澱2小時；10) 4°C全速離心20分鐘，沉澱RNA ;11)先用400 μ I 70%乙醇洗沉澱，然後用400 μ I 100%乙醇洗沉澱，吹乾後用100 μ I的二乙基焦碳酸酯處理的水溶解RNA ；12)用DNA酶處理提取的RNA，_20°C保存備用。將約5 μ g桉樹葉片組織的總RNA,採用Invitrogen公司的反轉錄試劑盒(Superscript III First Strand)合成 cDNA。二、WPGS3和WPGS4基因的克隆
將桉樹(品名DH32-29) cDNA送至公司(天津生物晶片技術有限公司)進行深度測序、(deep sequencing)以獲得cDNA全長序列。通過NCBI Genebank查找得到擬南芥GRFl和EBPl基因編碼的蛋白胺基酸序列，與桉樹全長cDNA序列進行相似性比對，得到桉樹中相似性最高的全長cDNA序列並分別命名為WPGS3和WPGS4，其中WPGS3和AtGRFl完全相同的胺基酸序列佔到90%，相似度為94%，而WPGS4和AtEBPl的完全相同的胺基酸序列佔到全長的79%，序列相似度84%ο由此得到WPGS3 全長 cDNA 序列(SEQ ID No 3)和 WPGS4 全長 cDNA 序列(SEQ IDNo :4)，據此設計克隆桉樹WPGS3和WPGS4的引物
WPGS3-F: AGAAGTAATGACGCGTGCCGCCGCCGCACCGWPGS3-R: GATGGGGCCCACGCGTGGCCTTGGCTGTTTCTTTGWPGS4-F: AGAAGTAATGACGCGTTCGGACGACGAGAGAGAGWPGS4-R: GATGGGGCCCACGCGTTCTGACCCATTTGGCATTAA
以現有的 Kary Mulis 研發的 Polymerase Chain Reaction (PCR)的方法,進行 WPGS3基因擴增，其擴增體系如下10 X pfx緩衝液5μ 1，硫酸鎂(50 mM) 2μ 1，dNTPs (10 mM)
Iμ 1，引物 GRFl-F (10 μ Μ) I μ 1，引物 GRFl-R (10 μ Μ) I μ 1，桉樹。0嫩模板2「 I,pfx 高保真酶O. 4 μ I (購自Takara公司)，水38 μ 1，總體積50 μ I。PCR擴增程序為先94°C預變性5分鐘；然後94°C 40秒，53 0C 40秒，68°C 40秒，共40個循環，最後68°C延伸5分鐘。其PCR產物參照QIAGEN公司的QIAquick膠純情化試劑盒進行膠純化。以現有的Polymerase Chain Reaction(PCR)的方法，進行WPGS4基因擴增，其擴增體系如下10 X Pfx 緩衝液 5 μ 1，硫酸鎂(50 mM) 2 μ 1，dNTPs (10 mM)l μ 1，引物 EBP1-F(10 μ Μ) I μ 1，引物 EBPl-R (10 μ Μ) 1μ 1，桉樹 cDNA 模板 2μ 1，pfx 高保真酶 0·4μ I (購自Takara公司)，水38 μ 1，總體積50 μ I。PCR擴增程序為先94°C預變性5分鐘；然後94 V 40秒，53 V 40秒，68 V 40秒，共40個循環，最後68 °C延伸5分鐘。其PCR產物參照QIAGEN公司的QIAquick膠純化試劑盒進行膠純化。三、WPGS3和WPGS4轉基因擬南芥的獲得及其性狀的觀察
根據New England Biolab的說明書將pEUV載體用MluI限制性內切酶在37°C酶切4小時使其變成線性，將膠純化後的目的基因PCR產物與線性的pEUV載體混合後利用Invitrogen公司的In-fusion試劑盒,將目的基因連結到pEUV表達載體轉化根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101用擴增基因的引物進行菌落PCR鑑定,對陽性克隆進行大量培養，通過蘸花浸染法轉化擬南芥，當代收穫為TO代轉基因種子。將TO代轉基因種子在含有50mg/L潮黴素(hygromycin)的MS培養基上進行篩選,得到轉基因陽性植株Tl代。Tl代植株成熟後得到T2代種子。最後將T2代種子播種在含有25mg/L潮黴素的MS培養基上進行篩選，只有轉入pEUV載體的種子才能在含有25mg/L潮黴素的MS培養基上發芽，發芽6天後轉入泥土定植，定期對成活植株的生長狀況進行各項生長指標的測量(株高，葉盤直徑，葉盤葉片數等)，並與在相同條件下生長的野生型擬南芥的生長指標(株高，葉盤直徑，葉盤葉片數等)進行比較。比較試驗結果可見圖3至圖5。如圖3A及圖3B所示，WPGS3過表達植株的葉盤直徑於播種27天後比野生型高出20%。如圖4A及圖4B所示，WPGS3過表達植株的植株高度在播種後34天比野生型高出20%。如圖5A及圖5B所示，WPGS 4過表達植株的葉盤直徑於播種41天後比野生型高出40%。權利要求
1.源於桉樹的增加植物生物量的基因，其特徵在於，包括WPGS3基因與WPGS4基因，所述WPGS3基因的cDNAs是下述核苷酸序列之一 1)序列表中SEQID NO: 3的DNA序列； 2)編碼序列表中SEQID NO: I的胺基酸酸序列； 而所述WPGS4基因的cDNAs是下述核苷酸序列之一 3)序列表中SEQID N0:4的DNA序列； 4)編碼序列表中SEQID NO:2的胺基酸酸序列。
2.—種重組表達載體，用於表達WPGS3基因或WPGS4基因，其特徵在於，該重組表達載體至少包括權利要求I所述的基因。
3.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特徵在於，該重組表達載體為pEUV。
4.一種提高植物生物量的方法，其特徵在於，將權利要求I所述的增加植物生物量的基因導入植物組織，細胞或器官，促使植物生物量獲得提高。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
全文摘要
本發明涉及兩個和增加植物生物量有關的桉樹基因WPGS3和WPGS4的序列與功能，屬於生物技術領域。首先提取桉樹中RNA，將其反轉錄成cDNA，再進行深度測序得到桉樹全長cDNA序列文庫。將桉樹cDNA文庫的序列與NCBI公布的擬南芥AtGRF1和AtEBP1蛋白的胺基酸序列進行相似性比較，得到桉樹中WPGS3和WPGS4全長cDNA序列。再將它們導入擬南芥中使其過表達。結果轉基因植株顯著地提高了生物量，此結果首次通過植物分子生物的方法確定了這兩個木本植物基因在雙子葉植物生長中的功能。
文檔編號A01H5/00GK102676537SQ201110063720
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月16日 優先權日2011年3月16日
發明者張俊, 潘昇 申請人:嘉漢林業(廣州)有限公司