穩定、乾燥的輪狀病毒疫苗、其組合物和製備其的方法

2023-05-14 16:52:56 2

專利名稱：穩定、乾燥的輪狀病毒疫苗、其組合物和製備其的方法
穩定、乾燥的輪狀病毒疫苗、其組合物和製備其的方法本發明內容關於穩定、乾燥的輪狀病毒疫苗、其組合物和製備其的方法。 發明領域本發明涉及輪狀病毒疫苗組合物，其可用於預防一種或多種輪狀病毒菌株的感染，其中穩定劑和乾燥過程可提供具有最小效能損失的固態製劑。
背景技術：
在發達和發展中國家兩者中，輪狀病毒不斷地被證明是幼兒和少年嚴重腹瀉的唯一的、最主要的病因。輪狀病毒腹瀉的後果是令人震驚的，在5歲以下的人群中，它們每年造成最高達592，000個人死亡，在發展中國家尤為突出(Parashar等人Emerg. Infect. Dis., 2003, 9:565-572)。最近，估計在發展中國家中每200個兒童中有1個兒童死於輪狀病毒腹瀉(Glass等人Lancet, 2004, 363 1547-1550)。在美國，在5歲以下的人群中，據估計每年輪狀病毒引起2，730，000例痢疾病的急性發作，410，000例去看醫生， 160，000例需要急診觀察，50，000例住院治療，和20例死亡(Tucker等人，JAMA, 1998， 279:1371-1376)。由此，在發達和發展中國家都需要使輪狀病毒疫苗，已受到國家和國際的認可。W02007009081已經建議發展中國家使用基於六價牛輪狀病毒(UK)的疫苗，以便不但覆蓋標準血清型Gl至G4，而且覆蓋新出現的血清型G8和G9。為了使保護程度更寬，先前已經討論了開發包括標準G1-G4菌株和G9、G8 菌株的六價輪狀病毒疫苗，參見Albert Ζ. Kapikian等人「A Hexavalent human Rotavirus-bovine Rotavirus reassortant vaccine designed for use in developing countries，，； National Institutes of Health； Journal of infectious diseases； 2005; 192; S22-9。輪狀病毒菌株在乾燥過程和儲存期間可能失去生存能力。先前已經報導，冷凍乾燥引起高達30%的病毒效能的損失。Wei Liu 等人(「Freeze drying of Proteins from a sucrose-glycine excepient system: Effect of formulation composition on initial recovery of protein activity" ； AAPS Pharm Scitech; Feb. 11，2005; 6(2) ； E150-E157)已經描述了含有蔗糖_甘氨酸組合的蛋白製劑。按照US 6616931、US 6403098和US 5932223的冷凍乾燥的輪狀病毒疫苗製劑， 包括大約IX IO5至大約1000X 105 pfu/mL的輪狀病毒菌株、糖1_20%(W/V)、磷酸鹽大約 0. 05-2M，和a) 0. 5%_1· 25%的重組人血清白蛋白，或b) 0. 1%_1· 25%的胺基酸(穀氨酸鹽、穀氨醯胺或精氨酸)。進一步的，這些專利還討論了通過在蔗糖/甘露糖醇穩定劑中包含甘氨酸(1%)來提高冷凍乾燥輪狀病毒製劑的穩定性。對於具有提高的生存能力和穩定性的輪狀病毒疫苗製劑，仍然有著顯著的需求。 現有技術穩定劑中沒有能夠提高生存能力和穩定性的。進一步的，為了在世界範圍內分配輪狀病毒疫苗，必須配製疫苗，以使它們在多種環境條件下保持穩定。
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意外地，現在已經發現a)包含蔗糖和甘氨酸組合的穩定劑組合物，和b)最佳冷凍乾燥循環導致輪狀病毒製劑具有小於3%的含水量和100%的單一病毒保存。發明概述
本發明涉及含有一種或多種穩定劑的組合物，其能夠製備固態的穩定的輪狀病毒疫苗。本發明提供了用作疫苗的新的輪狀病毒的製劑和它們的製備方法。本發明涉及疫苗穩定劑，疫苗製劑，優選賦予提高穩定性和生存能力的冷凍乾燥的單價和多價輪狀病毒疫苗。本發明的疫苗製劑包括有利比例的二糖(例如蔗糖)與胺基酸(例如甘氨酸)作為穩定劑組分。按照本發明，煉韌(annealing)優選在_20°C進行。在低於Tg的條件下進行初始乾燥，其中在升華(sublimation)的頭1200分鐘期間的最大產品溫度不越過_32°C。本發明的優點
實現快速和均勻的冷凍乾燥。·產生象餅塊一樣的化妝碰撞而反跳彈性碎片(Cosmetically carrom pieces), 在抗酸稀釋劑中具有良好的溶解性，具有0. 8至1. 5%的溼度(moisture)範圍。殘留含水量(moisture content)小於 3%。·通過冷凍乾燥和噴霧乾燥，穩定劑的組合物顯示了出色的保存效果(範圍 60-100%)。·在加工和冷藏時，冷凍乾燥和噴霧乾燥的產物顯示了良好的穩定性(生存能力)。·快速重組。本發明的詳細說明
本發明包括冷凍乾燥的輪狀病毒活疫苗製劑，其包含大約洲w/v至大約20% w/v蔗糖和21 w/v至大約20% w/v甘氨酸。在上述範圍之內，有用的亞組是大約3% w/v至大約10% w/v的蔗糖和大約3% w/v至大約10% w/v的甘氨酸。意外地，蔗糖與甘氨酸的這種有利的組合導致輪狀病毒活疫苗的穩定性提高和生存能力改善。按照本發明，有利的穩定劑組合物可以用於單價和多價製劑，其中多價製劑可以選自但不局限於二價、三價、四價和五價製劑。本發明使用的輪狀病毒菌株可以選自但不局限於血清型61、62、63、64、68、69、 P1、P2 禾口 P3。按照本發明的一個方面，疫苗製劑的二糖可以選自但不局限於蔗糖，甘露糖醇， 海藻糖，麥芽糖和乳糖。本發明的另一個方面是疫苗製劑的胺基酸可以選自但不局限於亮氨酸，異亮氨酸，組氨酸，甘氨酸，穀氨醯胺，精氨酸或丙氨酸。另外，本發明的穩定劑組合物可以包括或省略額外的組分，例如蛋白質水解產物， 人血清白蛋白和部分水解的凝膠。公開在本說明書中的優選組分範圍可以形成疫苗製劑，連同其它特性一起，顯示出提高的生存能力和穩定性(與本領域已知的疫苗製劑相比)。在本說明書中舉例說明的穩定劑組合物ι-ιν，可以引導普通技術人員制出基於同時存在蔗糖和甘氨酸(在本公開範圍內)的其它疫苗製劑。換句話說，意在包括每個製劑的比例、濃度和存在其它組分的方面的變化。各種穩定劑和最終疫苗製劑的範圍基於w/v來提供。本領域普通技術人員可以意識到，可以使用不同體積的疫苗穩定劑，以便實踐所主張的發明，這也需要改變穩定劑組分的濃度。作為本發明的例子(但絕非限制)，使用1:1.5的穩定劑病毒組合，以便制出最終的要加以冷凍乾燥的疫苗。然而，技術人員可以選擇不同比例的主要化學組分或使用具有改變的主要化學組分濃度的整體病毒製劑(bulk viral preparations)。因此，本發明的實質集中於蔗糖和甘氨酸在冷凍乾燥之前的疫苗製劑中的有利組合。尤其優選的製劑是使用穩定劑組合物I製備的。正如本節以及上述實施例所公開的那樣，可以加入比例大約0.5:1至大約1:5的二糖(例如蔗糖)和胺基酸(例如甘氨酸)，以產生與整體病毒製劑(bulk viral pr印arations)組合的疫苗穩定劑，從而制出用於冷凍乾燥的疫苗製劑，其導致上述的穩定性和生存能力。在上述範圍內，使用的蔗糖與甘氨酸的比例可以是1:1。製劑的冷凍乾燥循環可以包括a)在20至5°C之間的溫度下進行產物加載；b) 逐步冷凍，同時在每個溫度下保持，其中冷凍可以在低於_32°C的條件下進行，優選-30°C 至-450C，冷凍速度為0. 5至1°C /min ；c)在_20°C煉韌(annealing)5小時，而後在_45°C冷凍1小時；d)在初始乾燥期間的逐步升溫可以包括在每個溫度下充分地保持，導致在大約 55ybar的壓力下、在-32°C升華(sublimation)20小時；e) 二次乾燥可以包括在55ybar 的壓力下、在25°C至30°C、以0. 5至1°C /min的速率將產物加熱6_10小時。冷凍乾燥循環的全部時間可以是48小時。還意味著涉及按照管瓶說明和凍幹器設計的溫度和循環時間的變化。輪狀病毒的一個或多個菌株(需要針對其進行保護)，可以在合適的培養基中培養，並使其生長至所需要的水平。收集的病毒液體培養基(broth)可以以合適的比例與穩定劑組合物混合，而後可以進行乾燥過程。乾燥可以用冷凍乾燥器或噴霧乾燥器進行。實施例1 樣品收集和病毒分離
從私人醫務所獲得腹瀉幼兒的十個糞便樣品。將糞便收集在無菌容器中，收集之後，在 4°C保存6-10小時，或在-20°C長時間保存。對於用ELISA(使用得自於Generic Assay, Germany的輪狀病毒抗原檢測試劑盒)試驗的A組輪狀病毒，三個糞便樣品是陽性的。試驗所有三個樣品，以分離在MA104(猴子腎臟)細胞上。三個當中的一個在MA104細胞單層上顯示了明顯的細胞病變效應，在_70°C冷凍，並在37°C解凍之後，將其採集。將採集的病毒在-70°C保存在IOml等分樣品中。相同的病毒用於進一步感染MA104細胞(如果和當需要時)。將該分離物命名為SIIL-R0TA-02。該SIIL-R0TA-02分離物使用血清型特異引物用 RT-PCR表徵，並且稱為Gl血清型。實施例2
將106. 3克MEM粉末溶於9升(lit)注射用水中。將3克穀氨醯胺和15克碳酸氫鈉溶於MEM溶液中。使用MEM (MEM組合物，參考表1)培養輪狀病毒菌株SIIL-R0TA-02 (Gl)。含有MEM的單一病毒庫用於製備最終整體病毒製劑(final bulk)(參考表2，最終整體病毒製劑 (final bulk)中的病毒組合物)。研究四個不同的穩定劑混合物(具有下面列出的加入濃度)。用大約IOml 0. IN HCl將培養基的pH值調節至6. 0-8. 5，更具體地說，調節至7. 4。 將穩定劑溶液以2-10 X濃度進行高壓處理，或進行膜式過濾。將60份病毒與40份的各個穩定劑組合物結合。為了冷凍乾燥，將1 ml的最終病毒製劑(final bulk)填充在小玻璃管G ml) (USP 1型)中，每個病毒製劑(bulk)裝入200個管瓶中，用於冷凍乾燥。表1 :MEM組合物
權利要求
1.冷凍乾燥的輪狀病毒疫苗製劑，包括a)大約1至大約1000X105pfu/mL的至少一個輪狀病毒菌株；b)大約2至大約20%(w/v)的糖；c)大約2至大約20%(w/v)的至少一種胺基酸。
2.按照權利要求1的組合物，其中所述輪狀病毒在37°C儲存15個月之後，保持其效能的大約100%。
3.按照權利要求1的組合物，其中所述輪狀病毒在25°C儲存6個月之後，保持其效能的大約100%。
4.按照權利要求1的組合物，其中所述輪狀病毒在2至8°C儲存6個月之後，保持其效能的大約100%。
5.權利要求1的疫苗，其中以生物學有效濃度加入細胞培養基。
6.權利要求5的疫苗，其中所述細胞培養基是最小必需培養基。
7.按照權利要求1的製劑，其中所述至少一種糖選自一組蔗糖，甘露糖醇，海藻糖，麥芽糖，乳糖，山梨糖醇，葡萄糖和巖藻糖。
8.按照權利要求1的製劑，其中所述至少一種胺基酸選自一組亮氨酸，異亮氨酸，組氨酸，甘氨酸，穀氨醯胺，精氨酸和丙氨酸。
9.按照權利要求1的製劑，其中一旦與稀釋劑進行重組，PH值在大約pH5.5至大約 pH7. 5之間。
10.權利要求1的製劑，包括a)大約5%(w/v)的蔗糖；b)大約5%(w/v)的甘氨酸。
11.製備按照權利要求1的穩定輪狀病毒疫苗製劑的方法，包括a)在額外含有穀氨醯胺和碳酸氫鈉的MEM中培養輪狀病毒；b)製備穩定劑，該穩定劑含有大約0.5:1至大約1:5比例的蔗糖和甘氨酸；c)將病毒和穩定劑以大約1.5:1的比例混合；d)將穩定劑和病毒的混合物冷凍乾燥大約30小時至60小時，產生疫苗的冷凍乾燥形式，其殘留含水量為大約0. 8%至大約1. 4%。
12.權利要求11的製劑，其中蔗糖與甘氨酸的比例是1:1。
13.權利要求11的方法，其中冷凍乾燥是在擱板溫度下進行的，並且包括a)在25至-50°C之間的溫度下加載產物；b)逐步冷凍，同時在每個溫度下保持，其中冷凍是在低於_32°C的條件下進行的，優選-30°C至_45°C，冷凍速度範圍為大約0. 5至5°C /min ；c)在大約-15°C至_25°C的溫度範圍內煉韌5小時，而後在_45°C冷凍1小時；d)在初始乾燥期間逐步升溫，包括在每個溫度下充分保持，導致在_32°C、在大約 55 μ bar的壓力下進行升華大約10至30小時；e)二次乾燥包括在25°C至30°C，在55μ bar的壓力下，以0. 5至1°C /min的速率加熱產物6-10小時。
14.權利要求13的方法，其中冷凍乾燥是在擱板溫度下進行的，並且包括a)在20至5 °C之間的擱板溫度下加載產物；b)逐步冷凍，同時在每個溫度下保持，其中冷凍是在低於_32°C的條件下進行的，優選-30°C至_45°C，冷凍速度範圍為大約0. 5至1°C /min ；c)在_20°C的溫度下煉韌5小時，而後在_45°C冷凍1小時；d)在初始乾燥期間逐步升溫，包括在每個溫度下充分保持，導致在_32°C、在大約 55 μ bar的壓力下進行升華大約20小時；e)二次乾燥包括在25°C至30°C，在55μ bar的壓力下，以0. 5至1°C /min的速率加熱產物6-10小時。
15.權利要求13的方法，其中冷凍乾燥循環時間範圍是大約30至大約60小時，優選 48小時。
全文摘要
本發明提供了新的冷凍乾燥輪狀病毒疫苗製劑和它們的製備方法。該製劑包括疫苗穩定劑，其導致疫苗製劑的穩定性提高，並使其效能損失最小。該輪狀病毒疫苗製劑包括二糖(例如蔗糖)與胺基酸(例如甘氨酸)的有利的比例。冷凍乾燥導致病毒製劑具有100%病毒保存性能，並且殘餘水份為大約0.8%至1.4%。
文檔編號A61K39/15GK102202688SQ200980125578
公開日2011年9月28日 申請日期2009年11月6日 優先權日2008年11月7日
發明者J·K·扎德, R·M·德赫雷, S·S·皮薩爾 申請人:印度血清研究所有限公司