蔗糖酶診斷/測定試劑盒及蔗糖酶活性濃度測定方法
2023-05-15 00:49:46
專利名稱：蔗糖酶診斷/測定試劑盒及蔗糖酶活性濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種蔗糖酶診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定蔗糖 酶活性濃度的方法，屬於醫學/食品檢驗測定技術領域。
技術背景蔗糖酶(sucrase)的功能為將蔗糖水解成D-果糖和D-葡萄糖，又稱為 轉化酶(invertase)或蔗糖酶(sacchamse)。蔗糖酶-異麥芽糖酶缺乏，已 知人類一旦缺少其中一種酶，就會產生對二糖無耐性的遺傳病，有可能它 們是同在一個蛋白質上，屬單基因控制。蔗糖酶在高等植物蔗糖代謝中起 著關鍵的作用。蔗糖酶的檢測方法有(1) Nelson法，其原理是蔗糖酶可將蔗糖水解為葡萄糖和果糖，而葡萄糖在鹼性溶液中能將CU 2還原；砷鉬酸試劑與氧化亞銅生成藍色複合物(砷鉬藍)，在510nm波長下有正比於還原糖濃度的光密度，從而確定蔗糖酶的濃度。(2)水楊酸法蔗糖酶能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖，葡萄糖與3，5-二硝基水楊酸共熱後被還原成棕紅色的 氨基化合物，在一定濃度範圍內，葡萄糖的量和棕紅色物質顏色深淺程度 成一定比例。(3)用鄰甲苯胺試劑比色測定。 發明內容本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，連續監測4還原型煙醯胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變^:，得以測 定蔗糖酶活性濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的蔗糖 酶診斷/測定試劑盒，採用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全 自動生化分析儀上進行蔗糖酶活性濃度測定，而且測定速度快、準確度高， 因而可以得到切實的推廣應用。本發明蔗糖酶活性濃度測定方法原理如下 蔗糖蔗糖酶D-葡萄糖+ D-果糖 D-果糖+輔酶果糖脫氫酶脫氫果糖+還原型輔酶這種方法應用蔗糖酶(sucrase; EC3.2丄48)偶聯果糖脫氫酶(Fructose dehydrogenase; EC 1.1.1.124; EC 1.1.99.11)酶促反應連續監測法。蔗糖酶 酶解蔗糖反應產生果糖，再通過偶聯果糖脫氫酶的作用，最終將輔酶(在 340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從 而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處 吸光度上升的速度，可以測算蔗糖酶酶的活性濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明蔗糖酶診斷/測定試劑 較為理想緩衝液 lOOmmol/L 穩定劑 500 mmol/L3 mmol/L 30 mmol/L果糖脫氫酶 卯00 U/L本發明的蔗糖酶診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩衝液、穩定劑、輔酶、果糖脫氫酶、蔗糖。 試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩衝液、穩定劑、輔酶、蔗糖。 試劑2緩衝液、穩定劑、果糖脫氫酶。 輔酶、果糖脫氫酶、蔗糖在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒 可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩衝液、穩定劑、輔酶。 試劑2緩衝液、蔗糖。 試劑3緩衝液、穩定劑、果糖脫氫酶。輔酶、果糖脫氫酶、蔗糖在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。 試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試 劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定蔗糖酶活性濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一、本實施例的蔗糖酶診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L庶糖 30 mmol/L果糖脫氫酶 9000 U/L試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑；使用 前，加入純淨水，復溶後使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始吸光 度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測蔗糖酶樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1 分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值4180。加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出蔗糖酶的活性濃 度大小。 實施例二本實施例的蔗糖酶診斷/測定試劑為雙試劑，包括三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 穩定劑100mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 30 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L果糖脫氫酶 9000 U/L試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，起始吸光 度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測蔗糖酶樣品與試 劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲 時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值2170。加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出蔗糖酶的活性濃 度大小。 實施例三本實施例的蔗糖酶診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L穩定劑50 mmol/L試劑2mmol/L(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L30 mmol/L試劑3三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 100 mmol/L 穩定劑 500 mmol/L9000 U/L試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。 測定蔗糖酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反 應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm,測試副波長405nm， 被測蔗糖酶樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方 向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右， 理論K值2170。加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出蔗糖酶的活性濃 度大小。申請人經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發明的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。總之，實驗證明，採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好，便於推廣應用。
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的蔗糖酶活性濃度測定方法，其方法原理如下蔗糖 蔗糖酶 D-葡萄糖+D-果糖D-果糖+輔酶 果糖脫氫酶 脫氫果糖+還原型輔酶將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出蔗糖酶的活性濃度大小測定結果。
2. —種蔗糖酶診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩衝液 20-500 mmol/L穩定劑 1——4000 mmol/L輔酶 1- 6 mmol/L蔗糖 1- 50mmol/L果糖脫氫酶 1000——80000 U/L其特徵在於試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用； 也可以配製成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述蔗糖酶診斷/測定試劑盒，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、輔酶、果糖脫氫酶、蔗糖組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述蔗糖酶診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、輔酶、果糖脫氫酶、蔗糖組成雙劑試劑；試劑l， 由緩衝液、穩定劑、輔酶、蔗糖組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、果 糖脫氫酶組成。輔酶、果糖脫氫酶、蔗糖在試劑1或試劑2中的位置可
5. 根據權利要求2所述蔗糖酶診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、輔酶、果糖脫氫酶、蔗糖組成多劑試劑；試劑l， 由緩衝液、穩定劑、輔酶、組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、蔗糖組 成；試劑3，由緩衝液、穩定劑、果糖脫氫酶組成。輔酶、果糖脫氫酶、 蔗糖在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述蔗糖酶診斷/測定試劑盒，其特徵在於還包括穩 定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的蔗糖酶診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定蔗糖酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬於醫學/食品檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩衝液、輔酶、蔗糖、果糖脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出蔗糖酶的活性濃度大小。
文檔編號C12Q1/00GK101329264SQ20071002473
公開日2008年12月24日 申請日期2007年6月21日 優先權日2007年6月21日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司